Навлизането в клетката на SARS-CoV-2 зависи от ACE2 и TMPRSS2, и може да се блокира от клинично доказан протеазен инхибитор

Източник:

Преводач: Елица П. Иванова

Графичен абстракт

Най-важното

  • SARS-CoV-2 използва SARS-CoV рецептора ACE2 за навлизане в клетката гостоприемник
  • Шиповидният протеин на SARS-CoV-2 се праймира от TMPRSS2
  • Антитела срещу SARS-CoV шиповидния протеин може да предложи някаква защита срещу SARS-CoV-2

Накратко
Наскоро появилият SARS-коронавирус 2 (SARS-CoV-2) заплашва общественото здраве. Hoffmann и неговите сътрудници показват, че инфекцията, причинена от SARS-CoV-2 зависи от факторите на клетките гостоприемници ACE2 и TMPRSS2 и може да бъде блокирана от клинично доказан протеазен инхибитор. Тези открития могат да помогнат за установяване на възможности за превенция и лечение.

Markus Hoffmann,1,13,* Hannah Kleine-Weber,1,2,13  Simon Schroeder,3,4  Nadine Kru¨ ger,5,6  Tanja Herrler,7
Sandra Erichsen,8,9 Tobias S. Schiergens,10 Georg Herrler,5 Nai-Huei Wu,5 Andreas Nitsche,11 Marcel A. Mu¨ ller,3,4,12 Christian Drosten,3,4  и Stefan Po¨ hlmann1,2,14,*
1Infection Biology Unit, German Primate Center – Leibniz Institute for Primate Research, Go¨ ttingen, Germany
2Faculty of Biology and Psychology, University Go¨ ttingen, Go¨ ttingen, Germany
3Charite´ -Universita¨ tsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universita¨ t Berlin, Humboldt-Universita¨ t zu Berlin, and Berlin Institute of Health, Institute of Virology, Berlin, Germany
4German Centre for Infection Research, associated partner Charite´ , Berlin, Germany
5Institute of Virology, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany
6Research Center for Emerging Infections and Zoonoses, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany
7BG Unfallklinik Murnau, Murnau, Germany
8Institute for Biomechanics, BG Unfallklinik Murnau, Murnau, Germany
9Institute for Biomechanics, Paracelsus Medical University Salzburg, Salzburg, Austria
10Biobank of the Department of General, Visceral, and Transplant Surgery, Ludwig-Maximilians-University Munich, Munich, Germany 11Robert Koch Institute, ZBS 1 Highly Pathogenic Viruses, WHO Collaborating Centre for Emerging Infections and Biological Threats, Berlin, Germany
12Martsinovsky Institute of Medical Parasitology, Tropical and Vector Borne Diseases, Sechenov University, Moscow, Russia
13Тези автори имат равен принос
14Главен контакт *За кореспонденция: mhoffmann@dpz.eu (M.H.), spoehlmann@dpz.eu (S.P.) https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052

Резюме

Скорошната поява на новия, патогенен SARS-коронавирус 2 (SARS-CoV-2) в Китай и бързото му национално и международно разпространение представляват глобална опасност за здравето. Клетъчното навлизане на коронавирусите зависи от свързването на вирусни шиповидни (S) протеини с клетъчните рецептори и от S протеиновото праймиране от протеази на клетките гостоприемници. Разгадаването на това кои клетъчни фактори се използват от SARS-CoV-2 за навлизане може да даде поглед върху вирусното предаване и да разкрие терапевтични цели. Тук ние демонстрираме, че SARS-CoV-2 използва SARS-CoV рецептора ACE2 за навлизане и сериновата протеаза TMPRSS2 за S протеиново праймиране. TMPRSS2 инхибитор, одобрен за клинична употреба, блокира влизането и може да представлява възможност за лечение. И накрая показваме, че серумите от оздравяващи от SARS пациенти кръстосано неутрализират SARS-2-S-насоченото навлизане. Нашите резултати разкриват важни общи неща между инфекцията със SARS-CoV-2 и със SARS-CoV и идентифицират потенциална цел за антивирусно повлияване.

ВЪВЕДЕНИЕ

Няколко от членовете на семейство Coronaviridae постоянно циркулират в човешката популация и обикновено причиняват леко респираторно заболяване (Corman et al., 2019). За разлика от тях тежкият остър респираторен синдром коронавирус (SARS-CoV) и коронавирусът на респираторния синдром от Близкия изток (MERS-CoV) се предават от животни на хора и причиняват тежки респираторни заболявания съответно на засегнати индивиди, SARS и MERS, съответно (Fehr et al., 2017). SARS се появи през 2002 г. в провинция Гуандун, Китай, а последеното му разпространение в световен мащаб беше свързано с 8 096 случая и 774 смъртни случая (de Wit et al., 2016; WHO, 2004). Китайските подковоносови прилепи служат като гостоприемници на природен резервоар за SARS-CoV (Lau et al., 2005; Li et al., 2005a). Човешкото предаване се улеснява от междинни гостоприемници като цивитни котки и миещи мечки, които често се продават като хранителни източници на черните пазари в Китай (Guan et al., 2003). Понастоящем няма специфични антивирусни лекарства или одобрени ваксини за борба със SARS и пандемията от SARS през 2002 г. и 2003 г. най-накрая беше спряна от конвенционални мерки за контрол, включително ограничения за пътуване и изолация на пациента. През декември 2019 г. се появи нова инфекциозна респираторна болест в Ухан, провинция Хубей, Китай (Huang et al., 2020; Wang et al., 2020; Zhu et al., 2020). Първоначалната група от инфекции беше свързана с пазара за морски дарове в Хуанан, потенциално поради контакт с животни. Впоследствие настъпи предаване от човек на човек (Chan et al., 2020) и болестта, сега наричана коронавирусна болест 19 (COVID-19), бързо се разпространи в Китай. Нов коронавирус, SARS-коронавирус 2 (SARS-CoV-2), който е тясно свързан със SARS-CoV, е открит при пациенти и се смята, че е етиологичен причинител на новата белодробна болест (Zhu et al., 2020). На 12 февруари 2020 г. в Китай са съобщени общо 44 730 лабораторно потвърдени инфекции, включително 8 204 тежки случая и 1 114 смъртни случая (WHO, 2020). Инфекциите бяха открити и в 24 страни извън Китай и бяха свързани с международни пътувания. Понастоящем не е известно дали приликите на последователността между SARS-CoV-2 и SARS-CoV се превръщат в сходни биологични свойства, включително пандемичен потенциал (Munster et al., 2020).

Фигура 1. SARS-2-S и SARS-S улесняват навлизането в подобен панел от клетъчни линии на бозайници
(A) Схематична илюстрация на SARS-S, включваща функционални домени (RBD, рецептор свързващ домен; RBM, рецептор свързващ мотив; TD, трансмембранен домен) и места за протеолитично срязване (S1/S2, S20). Последователностите на аминокиселините около двете места за разпознаване на протеаза (червено) са показани за SARS-S и SARS-2-S (звездичките показват консервативни остатъци). Главите на стреличките указват мястото на срязване.
(B) Анализ на експресията на SARS-2-S (горен панел) и включване на псевдотип (долен панел) чрез уестърн блот, като се използва антитяло, насочено срещу С-крайния хемаглутинин (HA) маркер, добавен към анализираните вирусни S протеини. Показани са представителни блотове от три експеримента. b-Актин (клетъчни лизати) и VSV-M (частици) служат като контроли на зареждане (М, матричен протеин). Главите на черните стрелки означават ивици, съответстващи на неразделени S протеини (S0), докато главите на сивите стрелки означават ивици, съответстващи на субединицата S2.
(C) Клетъчните линии от човешки и животински произход се инокулират с псевдотипен VSV, съдържащ VSV-G, SARS-S или SARS-2-S. На 16 часа след постинокулацията се анализира навлизането на псевдотип чрез определяне на луциферазната активност в клетъчните лизати. Сигнали, получени за частици, които нямат протеин в обвивката, са използвани за нормализиране. Показани са средните стойности на три независими експеримента. Стълбчетата на грешките означават SEM. Необработените данни от един експеримент са представени на Фигура S1.

Шиповидният (S) протеин на коронавирусите улеснява навлизането на вируса в целевите клетки. Навлизането зависи от свързването на повърхностната единица, S1, на S протеина с клетъчния рецептор, което улеснява вирусното прикрепване към повърхността на целевите клетки. В допълнение навлизането изисква S протеиново праймиране посредством клетъчни протеази, което води до срязване на S протеина в S1/S2 и S2′ мястото и позволява сливане на вирусни и клетъчни мембрани, процес, ръководен от субединицата S2 (Фигура 1А). SARS-S ангажира ангиотензин-конвертиращия ензим 2 (ACE2) като входен рецептор (Li et al., 2003) и използва клетъчната серинова протеаза TMPRSS2 за праймиране на S протеина (Glowacka et al., 2011; Matsuyama et al., 2010; Shulla et al., 2011). Интерфейсът SARS-S/ACE2 е изяснен на атомно ниво и ефективността на използването на ACE2 е установена като ключов фактор за преносимостта на SARS-CoV (Li et al., 2005a, 2005b). SARS-S и SARS-2-S споделят ~ 76% идентичност на аминокиселини. Не е известно обаче дали SARS-2-S като SARS-S използва ACE2 и TMPRSS2 за навлизане в клетката на гостоприемника.

РЕЗУЛТАТИ

Доказателство за ефективна протеолитична обработка на SARS-2-S

Целта на нашето проучване беше да се добие представа как SARS-2-S улеснява навлизането на вируса в целевите клетки и как този процес може да бъде блокиран. За това първо се запитахме дали SARS-2-S е силно експресиран в човешка клетъчна линия, 293T, често използвана за експериментиране поради високата си трансфектируемост. Освен това анализирахме дали има доказателства за протеолитична обработка на S протеин, тъй като някои коронавирусни S протеини се срязват от протеази на клетки гостоприемници на мястото на срязване S1/S2 в инфектираните клетки (Фигура 1А). Имуноблот анализ на 293Т клетки, експресиращи SARS-2-S протеин с С-краен антигенен маркер, разкри ивица с молекулно тегло, очаквано за непроцесиран S протеин (S0) (Фигура 1В). Ивица с размер, очакван за S2 субединица на S протеина, също се наблюдава в клетки и по-ясно при частици от везикуларен стоматит (VSV), носещи SARS-2-S (Фигура 1B). За разлика от тях S2 сигнал до голяма степен отсъства в клетките и частици, експресиращи SARS-S (Фигура 1B), както беше документирано по-рано (Glowacka et al., 2011; Hofmann et al., 2004b). Тези резултати предполагат ефективна протеолитична обработка на SARS-2-S в човешки клетки, в съответствие с наличието на няколко остатъци от аргинин на мястото на срязване на S1/S2 на SARS-2-S, но не и на SARS-S (Фигура 1А). За разлика от това, мястото на срязване на S2 на SARS-2-S е подобно на това на SARS-S.

SARS-2-S и SARS-S медиират навлизането в подобен спектър от клетъчни линии

Дефектните за репликация VSV частици, носещи коронавирус S протеини, отразяват вярно ключовите аспекти на влизането на коронавирус в клетки гостоприемници (Kleine-Weber et al., 2019). Ние използваме VSV псевдотипове, носещи SARS-2-S, за да изследваме навлизането в клетките на SARS-CoV-2. SARS-2-S и SARS-S са здраво включени във VSV частиците (Фигура 1B), което позволява значимо съпоставяне един на друг; въпреки че, формално, сравнимото включване на частици на S1 субединицата остава да бъде демонстрирано. Първо се запитахме кои клетъчни линии са податливи на навлизане, предизвикано от SARS-2-S, използвайки съответно панел от добре характеризирани клетъчни линии от човешки и животински произход. Всички клетъчни линии са лесно податливи на навлизане, предизвикано от гликопротеина на пантропния VSV (VSV-G) (Фигура 1С; Фигура S1), както се очакваше. Повечето човешки клетъчни линии и животинските клетъчни линии Vero и MDCKII също са податливи на навлизане, предизвикано от SARS-S (Фигура 1С). Нещо повече, SARS-2-S улеснява навлизането в идентичен спектър от клетъчни линии като SARS-S (фигура 1С), което предполага сходства в избора на входящи рецептори.

SARS-CoV-2 използва SARS-CoV рецептор за навлизане в клетка гостоприемник

За да изясним защо SARS-S и SARS-2-S медиират влизането в едни и същи клетъчни линии, след това установихме дали SARS-2-S съдържа аминокиселинни остатъци, необходими за взаимодействие с входящ рецептор на SARS-S, ACE2. Анализът на последователността показа, че SARS-CoV-2 клъстери с вируси, свързани с SARS-CoV от прилепи (SARSr-CoV), от които някои, но не всички могат да използват ACE2 за навлизане в клетката на гостоприемника (Фигура 2А; Фигура S2). Анализът на мотива за свързване на рецептора (RBM), част от домена на свързване на рецептора (RBD), който осъществява контакт с ACE2 (Li et al., 2005a), разкри, че повечето остатъци от аминокиселини, необходими за свързването с ACE2 от SARS-S, са консервативни в SARS-2-S (Фигура 2В). За разлика от тях повечето от тези остатъци отсъстват от S протеини на SARSr-CoV, за които преди това е установено, че не използват ACE2 за навлизане (Фигура 2В) (Ge et al., 2013; Hoffmann et al., 2013; Menachery et al., 2020). В съгласие с тези открития насочена експресия на човешки и прилепови (Rhinolophus alcyone) ACE2, но не и на човешки DPP4, входящият рецептор, използван от MERS-CoV (Raj et al., 2013), или човешкият APN, входящият рецептор, използван от HCoV- 229E (Yeager et al., 1992), позволи SARS-2-S- и SARS-S-предизвиканото навлизане в други нечувствителни BHK-21 клетки (Фигура 3А). Нещо повече антисерумът, повдигнат срещу човешки ACE2, блокира SARS-S- и SARS-2-S-, но не и VSV-G- или MERS-S предизвикано навлизане (Фигура 3В). И накрая автентичните SARS-CoV-2 клетки, заразени с BHK-21, трансфектирани да експресират ACE2 клетки, но не и родителски BHK-21 клетки с висока ефективност (Фигура 3С), което показва, че SARS-2-S, подобно на SARS-S, използва ACE2 за клетъчно навлизане.

Клетъчната серинова протеаза TMPRSS2 праймира SARS-2- S за навлизане и инхибитор на сериновата протеаза блокира инфекцията на белодробните клетки SARS-CoV-2

След това проучихме протеазната зависимост от SARS-CoV-2. SARS-CoV може да използва ендозомните цистеинови протеази катепсин В и L (CatB/L) (Simmons et al., 2005) и сериновата протеаза TMPRSS2 (Glowacka et al., 2011; Matsuyama et al., 2010; Shulla et al. , 2011) за праймиране на S протеин в клетъчни линии и се изисква инхибиране на двете протеази за стабилна блокада на навлизане на вируса (Kawase et al., 2012). Въпреки това само активността на TMPRSS2 е от съществено значение за разпространението на вируса и патогенезата на заразения гостоприемник, докато CatB/L активността може да се пренебрегне (Iwata-Yoshikawa et al., 2019; Shirato et al., 2016; Shirato et al., 2018; Zhou et al., 2015).

За да определим дали SARS-CoV-2 може да използва CatB/L за навлизане в клетки, първоначално използваме амониев хлорид, който повишава ендозомното рН и по този начин блокира активността на CatB/L. 293T клетки (TMPRSS2-, трансфектирани да експресират ACE2 за силно S-протеин предизвикано навлизане) и Caco-2 клетки (TMPRSS2 +) са използвани като мишени. Амониевият хлорид блокира VSV-G-зависимото влизане в двете клетъчни линии, докато навлизането, предизвикано от Nipah вирус F и G протеини, не е засегнато (Фигура S3A; данните не са показани), съответстващо на Nipah вируса, но не на VSV да може да се слее директно с плазмената мембрана (Bossart et al., 2002). Третирането с амониев хлорид силно инхибира SARS-2-S- и SARS-S предизвикано навлизане в TMPRSS2- 293T клетки (Фигура S3 A), което предполага зависимост от CatB/L. Инхибирането на навлизането в TMPRSS2 + Caco-2 клетки е по-малко ефективно в сравнение с 293T клетки (Фигура S3 A), което би било съвместимо с SARS-2-S праймиране от TMPRSS2 в клетки Caco-2. В действителност клинично доказаният инхибитор на серинова протеаза камостат мезилат, който е активен срещу TMPRSS2 (Kawase et al., 2012), частично блокира SARS-2-S предизвиканото навлизане в Caco-2 (Фигура S3 B) и Vero -TMPRSS2 клетки (Фигура 4А). Пълно инхибиране е постигнато, когато са добавени камостат мезилат и Е-64d, инхибитор на CatB/L (Фигура 4А; Фигура S3B), което показва, че SARS-2-S може да използва както CatB/L, така и TMPRSS2 за праймиране в тези клетъчни линии. За разлика от това камостат мезилатът не пречи на SARS-2-S-предизвиканото навлизане в TMPRSS2-клетъчните линии 293T (фигура S3B) и Vero (фигура 4А), което е ефективно блокирано от E-64d и следователно е CatB/L зависимо. Нещо повече насочената експресия на TMPRSS2 спасява SARS-2- S-предизвиканото навлизане от инхибиране от E-64d (Фигура 4В), потвърждавайки, че SARS-2-S може да използва TMPRSS2 за S протеиново праймиране.

След това анализирахме дали използването на TMPRSS2 е необходимо за инфекция на SARS-CoV-2 на белодробните клетки. Действително, камостат мезилатът значително намалява MERS-S-, SARS-S- и SARS-2-S-, но не и VSV-G-предизвиканото навлизане в белодробната клетъчна линия Calu-3 (Фигура 4С) и не проявява нежелани цитотоксични ефекти ( Фигура S3 С). По същия начин третирането с камостат мезилат значително намалява инфекцията с Calu-3 с автентичен SARS-CoV-2 (Фигура 4D). И накрая третирането с камостат мезилат с инхибира SARS-S- и SARS-2-S-, но не и VSV-G-предизвикано навлизане в първичните белодробни клетки на човека (Фигура 4Е).

Фигура 2. Остатъци от аминокиселини на SARS-2-S, критични за свързването с ACE2
(A) S протеинът на SARS-CoV-2 се групира филогенетично в клъстери със S протеини на известни бетакоронавируси, свързани с прилепи (вж. Фигура S2 за повече подробности).
(B) Привеждане на мотива за свързване на рецептора на SARS-S със съответните последователности на бетакоронавирусни S протеини, свързани с прилепи, които са в състояние или не могат да използват ACE2 като клетъчен рецептор, разкрива, че SARS-CoV-2 притежава решаващи аминокиселинни остатъци за свързване към ACE2.
Фигура 3. SARS-2-S използва ACE2 като клетъчен рецептор
(A) BHK-21 клетки, преходно експресиращи ACE2 от човешки или прилепов произход, човешки APN или човешки DPP4, се инокулират с псевдотипен VSV, съдържащ VSVG, SARS-S, SARS-2-S, MERS-S или 229E-S. На 16 часа след постинокулацията се анализира въвеждането на псевдотип (нормализиране срещу частици без протеини в обвивката на вируса).
(B) Нетретирани Vero клетки, както и Vero клетки, предварително инкубирани с 2 или 20 mg/mL анти-ACE2 антитяло или несвързано контролно антитяло (анти-DC-SIGN, 20 mg/mL), се инокулират с псевдотипен VSV, съдържащ VSV- G, SARS-S, SARS-2-S или MERS-S. На 16 часа след постнокулацията се анализира навлизането на псевдотип (нормализиране срещу нетретирани клетки).
(С) BHK-21 клетки, трансфектирани с ACE2-кодиращ плазмид или контролни, трансфектирани с DsRed-кодиращ плазмид, са инфектирани с SARS-CoV-2 и промити и геномните еквиваленти в супернатантите на културата се определят от количествен RT-PCR.
Средната стойност на три независими експеримента, проведени с проби в три повторения, е показана в (A–C). Стълбчетата на грешки означават SEM. Статистическата значимост е тествана с двуфакторен дисперсионен анализ с посттест на Дънет. Клетките, трансфектирани с празен вектор, служат като референция в (А), докато клетките, които не са третирани с антитела, служат като референция в (В).

Най-общо SARS-CoV-2 може да използва TMPRSS2 за праймиране на протеин S и камостат мезилат, инхибитор на TMPRSS2, блокира инфекцията от SARS-CoV-2 в белодробните клетки.

Доказателство, че антителата, повдигнати срещу SARS-CoV, ще пресекат неутрализирането на SARS-CoV-2

Оздравяващите от SARS пациенти проявяват неутрализиращ отговор с антитела, насочен срещу вирусен S протеин (Liu et al., 2006). Изследвахме дали такива антитела блокират навлизането, предизвикано от SARS-2-S. Четири серума, получени от трима пациенти, оздравяващи от SARS, инхибират SARS-S-, но не и VSV-G-предизвиканото навлизане по зависим от концентрацията начин (Фигура 5). В допълнение тези серуми също намаляват SARS-2-S-предизвиканото навлизане, макар и с по-ниска ефективност в сравнение със SARS-S (Фигура 5). По подобен начин, заешки серуми, повдигнати срещу S1 субединица на SARS-S, намаляват както SARS-S-, така и SARS-2-S-предизвиканото навлизане с висока ефективност и отново инхибирането на SARS-S-предизвиканото навлизане е по-ефективно. По този начин отговорите на антителата, повдигнати срещу SARS-S по време на инфекция или ваксинация, могат да осигурят известна степен на защита срещу инфекция със SARS-CoV-2.

ОБСЪЖДАНЕ

Настоящото проучване предоставя доказателства, че навлизането в клетка гостоприемник на SARS-CoV-2 зависи от SARS-CoV рецептора ACE2 и може да бъде блокирано от клинично доказан инхибитор на клетъчната серинова протеаза TMPRSS2, който се използва от SARS-CoV-2 за S протеиново праймеране. Нещо повече, това предполага, че отговорите на антитела, повдигнати срещу SARS-CoV, могат поне частично да защитят срещу инфекция SARS-CoV-2. Тези резултати имат важно значение за нашето разбиране на преносимостта и патогенезата на SARS-CoV-2 и разкриват цел за терапевтична интервенция.

Констатацията, че SARS-2-S използва ACE2 за навлизане, което също беше докладвано от Zhou и колегите му (Zhou et al., 2020), докато настоящият ръкопис беше пратен за разглеждане, предполага, че вирусът може да е насочен към подобен спектър от клетки като SARS-CoV. В белия дроб SARS-CoV заразява главно пневмоцитите и макрофагите (Shieh et al., 2005). Експресията на АСЕ2 обаче не се ограничава до белия дроб и се наблюдава извънбелодробно разпространение на SARS-CoV в ACE2+ тъкани (Ding et al., 2004; Gu et al., 2005; Hamming et al., 2004). Същото може да се очаква и за SARS-CoV-2, въпреки че афинитетът на SARS-S и SARS-2-S към ACE2 остава да се сравнява. Предполага се, че скромната експресия на АСЕ2 в горните дихателни пътища (Bertram et al., 2012; Hamming et al., 2004) може да ограничи преносимостта на SARS-CoV. Предвид потенциално повишената преносимост на SARS-CoV-2 по отношение на SARS-CoV, може да се спекулира, че новите вируси могат да използват фактори, стимулиращи клетъчното свързване с по-висока ефективност от SARS-CoV, за да осигурят стабилна инфекция на ACE2+ клетките в горните дихателни пътища. Това може да включва свързване с клетъчни гликани, функция, приписана на S1 домена на определени коронавируси (Li et al., 2017; Park et al., 2019). И накрая, трябва да се отбележи, че експресията на ACE2 предпазва от увреждане на белите дробове и се регулира понижено от SARS-S (Haga et al., 2008; Imai et al., 2005; Kuba et al., 2005), което може да предизвика SARS. По този начин ще бъде интересно да се определи дали SARS-CoV-2 също пречи на експресията на ACE2.

Праймирането на S протеини на коронавирус чрез протеази на клетките гостоприемници е от съществено значение за навлизането на вируса в клетките и включва срязването на S протеина в S1/S2 и S2 местата. Мястото на срязване на S1/S2 на SARS-2-S съдържа няколко остатъци от аргинин (многоосновни), което показва висок потенциал на срязване. В действителност SARS-2-S ефикасно се срязва в клетките, а срязаният S протеин се включва във VSV частици. По-специално, последователността на мястото на срязване може да определи зоонотичния потенциал на коронавирусите (Menachery et al., 2020; Yang et al., 2014, 2015), а многоосновно място на срязване не присъства в RaTG13, коронавирусът, който е най-тясно свързан със SARS- CoV-2. По този начин ще бъде интересно да се определи дали наличието на многоосновен участък на срязване е необходимо за навлизане на SARS-CoV-2 в човешки клетки и как е придобито това място на срязване.

Фигура 4. SARS-2-S използва TMPRSS2 за S протеиново праймиране в човешки белодробни клетки
(A) Значението на активността на CatB/L или TMPRSS2 за навлизане в приемната клетка на SARS-CoV-2 е оценено чрез добавяне на инхибитори към целевите клетки преди трансдукция. Е-64d и камостат мезилат блокират активността на CatB/L и TMPRSS2, съответно (допълнителни данни за 293T клетки, преходно експресиращи ACE2 и Caco-2 клетки са показани на фигура S3).
(B) За да се анализира дали TMPRSS2 може да спаси SARS-2-S-задвижваното влизане в клетки с ниска CatB/L активност, 293T клетки, преходно експресиращи ACE2 самостоятелно или в комбинация с TMPRSS2, са инкубирани с CatB/L инхибитор E-64d или DMSO като контролна и инокулирана с псевдотипове, носещи указаните вирусни повърхностни протеини.
(С) Calu-3 клетките се инкубират предварително с посочените концентрации на камостат мезилат и впоследствие се инокулират с псевдочастици, придружаващи посочените вирусни гликопротеини.
(D) Calu-3 клетките се инкубират предварително с камостат мезилат и се инфектират с SARS-CoV-2. Впоследствие клетките се промиват и генетичните еквиваленти в супернатантите на културата се определят чрез количествен RT-PCR.
(Е) За да се проучи дали е необходима активността на сериновата протеаза за навлизане, предизвикано от SARS-2-S в човешки белодробни клетки, първичните епителни клетки на дихателните пътища са инкубирани с камостат мезилат преди трансдукция.
Средната стойност на три независими експеримента, проведени с трикратни или четирикратни проби, е показана в (A–E). Стълбчетата на грешките означават SEM. Статистическата значимост е тествана от двуфакторен дисперсионен анализ ANOVA с посттест тест на Дънет. Клетките, които не получават инхибитор, служат като референция в (A), (C), (D) и (E), докато клетките, трансфектирани с празен вектор и нетретирани с инхибитор, служат като референция в (B).

S протеините на SARS-CoV могат да използват ендозомните цистеинови протеази CatB/L за S протеиново праймиране в TMPRSS2-клетки (Simmons et al., 2005). Въпреки това, S протеиновото праймиране от TMPRSS2, но не и от CatB/L е от съществено значение за навлизане на вируса в първичните целеви клетки и за разпространение на вируса в заразения гостоприемник (Iwata-Yoshikawa et al., 2019; Kawase et al., 2012; Zhou et al. , 2015). Настоящото проучване показва, че разпространението на SARS-CoV-2 също зависи от активността на TMPRSS2, въпреки че отбелязваме, че инфекцията на SARS-CoV-2 в клетките Calu-3 е инхибирана, но не е отменена от камостат мезилат, което вероятно отразява остатъчно S протеиново праймиране от CatB/L. Човек може да спекулира, че медиираното с фурин предварително срязване на S1/S2 в инфектирани клетки може да насърчи последващо TMPRSS2-зависимо навлизане в целеви клетки, както се съобщава за MERS-CoV (Kleine-Weber et al., 2018; Park et al., 2016; 2016 ). Съвместно, нашите настоящи открития и предишна работа подчертават TMPRSS2 като фактор на клетката гостоприемник, който е критичен за разпространението на няколко клинично значими вируса, включително вируси на грип А и коронавируси (Gierer et al., 2013; Glowacka et al., 2011); Iwata-Yoshikawa et al., 2019; Kawase et al., 2012; Matsuyama et al., 2010; Shulla et al., 2011; Zhou et al., 2015). За разлика от това TMPRSS2 е необходим за развитие и хомеостаза (Kim et al., 2006) и по този начин представлява привлекателна цел за лекарства. В този контекст е важно да се отбележи, че серинопротеазният инхибитор камостат мезилат, който блокира TMPRSS2 активността (Kawase et al., 2012; Zhou et al., 2015), е одобрен в Япония за човешка употреба, но за несвързана индикация. По този начин тези съединения са свързани с потенциално повишена антивирусна активност (Yamamoto et al., 2016) и могат да се считат за потенциални за лечение, което още не е прието при пациенти, инфектирани с SARS-CoV-2.

Пациентите, оздравяващи от SARS проявяват неутрализиращ отговор на антитела, който може да бъде открит дори 24 месеца след инфекцията (Liu et al., 2006) и това до голяма степен е насочено срещу S протеина. Нещо повече експерименталните SARS ваксини, включително рекомбинантния S протеин (He et al., 2006) и инактивиран вирус (Lin et al., 2007), индуцират неутрализиращи реакции на антитела. Въпреки че потвърждението с инфекциозен вирус е в очакване, нашите резултати показват, че неутрализиращите реакции на антитела, повдигнати срещу SARS-S, могат да осигурят някаква защита срещу SARS-CoV-2 инфекция, която може да има последици за контрол на огнището.

Накратко това проучване дава ключова информация за първата стъпка на SARS-CoV-2 инфекция, проникване на вируси в клетките и дефинирани потенциални цели за антивирусна интервенция.

Фигура 5. Серуми от пациенти, оздравяващи от SARS кръстосано неутрализират SARS-2-S-предизвикано навлизане
Псевдотиповете, които носят указаните вирусни повърхностни протеини, се инкубират с различни разреждания на серуми от трима оздравяващи пациенти със SARS или серуми от зайци, имунизирани със S1 субединица на SARS-S и впоследствие инокулирани върху клетки Vero, за да се оцени потенциалът на кръстосана неутрализация. Показани са средните три независими експеримента, проведени с проби в три повторения. Стълбчетата на грешките означават SEM. Статистическата значимост е тествана от двуфакторен дисперсионен анализ с посттест на Дънет.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарим на Heike Hofmann-Winkler за обсъждането, Andrea Maisner за Nipah F и G експресионните плазмиди, Anette Teichmann за техническата помощ и Roberto Cattaneo за плазмид pCG1. Благодарим за подкрепата на фондацията с нестопанска цел HTCR, която съхранява човешки тъканни проби, което ги прави широко достъпни за научни изследвания на етична и правна основа. С признателност благодарим на авторите и създаващите и изпращащите лаборатории за последователностите и метаданни, споделени чрез GISAID, на които се основава това изследване. Тази работа беше подкрепена от BMBF (RAPID Consortium, 01KI1723D и 01KI1723A на C.D. и S.P.) и Германската фондация за изследвания (DFG) (WU 929/1-1 на N.-H.W.).

ПРИНОС НА АВТОРИТЕ

Концепция, M.H. и S.P.; Формален анализ, M.H., H.K.-W., M.A.M., и  S.P.;  Изследване,  M.H.,  H.K.-W., S.S.,  N.K., T.H.,  N.-H.W. и M.A.M.; Източници, T.H., S.E., T.S.S., G.H., A.N., M.A.M. и C.D.; Писане – Оригинална чернова, M.H. и S.P.; Писане – Обзор  & Корекция, всички автори; Придобиване на финансирането, S.P., N.-H.W. и C.D.

КОНФЛИКТ НА ИНТЕРЕСИ

Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

ЛИТЕРАТУРА

Berger Rentsch, M., and Zimmer, G. (2011). A vesicular stomatitis virus repli- con-based bioassay for the rapid and sensitive determination of multi-species type I interferon. PLoS ONE 6, e25858.

Bertram, S., Glowacka, I., Blazejewska, P., Soilleux, E., Allen, P., Danisch, S., Steffen, I., Choi, S.Y., Park, Y., Schneider, H., et al. (2010). TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. J. Virol. 84, 10016–10025.

Bertram, S., Heurich, A., Lavender, H., Gierer, S., Danisch, S., Perin, P., Lucas, J.M., Nelson, P.S., Po¨ hlmann, S., and Soilleux,  E.J. (2012). Influenza and SARS-coronavirus activating proteases TMPRSS2 and HAT are expressed at multiple sites in human respiratory and gastrointestinal tracts. PLoS ONE 7, e35876.

Bossart, K.N., Wang, L.F., Flora, M.N., Chua, K.B., Lam, S.K., Eaton, B.T., and Broder, C.C. (2002). Membrane fusion tropism and heterotypic functional ac- tivities of the Nipah virus and Hendra virus envelope glycoproteins. J. Virol. 76, 11186–11198.

Brinkmann, C., Hoffmann, M., Lu¨ bke, A., Nehlmeier, I., Kra¨ mer-Ku¨ hl, A., Win- kler, M., and Po¨ hlmann, S. (2017). The glycoprotein of vesicular stomatitis virus promotes release of virus-like particles from tetherin-positive cells. PLoS ONE 12, e0189073.

Buchholz, U., Mu¨ ller, M.A., Nitsche, A., Sanewski, A., Wevering, N., Bauer- Balci, T., Bonin, F., Drosten, C., Schweiger, B., Wolff, T., et al. (2013). Contact investigation of a case of human novel coronavirus infection treated in a German hospital, October-November 2012. Euro Surveill. 18, 20406.

Chan, J.F., Yuan, S., Kok, K.H., To, K.K., Chu, H., Yang, J., Xing, F., Liu, J., Yip, C.C., Poon, R.W., et al. (2020). A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet 395, 514–523.

Corman, V.M., Lienau, J., and Witzenrath, M. (2019). [Coronaviruses as the cause of respiratory infections]. Internist (Berl.) 60, 1136–1145.

Corman, V.M., Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, D.K., Bleicker, T., Bru¨ nink, S., Schneider, J., Schmidt, M.L., et al. (2020). Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 25 https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.

de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., and Munster, V.J. (2016). SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nat. Rev. Microbiol. 14, 523–534.

Ding, Y., He, L., Zhang, Q., Huang, Z., Che, X., Hou, J., Wang, H., Shen, H., Qiu, L., Li, Z., et al. (2004). Organ distribution of severe acute respiratory syndrome (SARS) associated coronavirus (SARS-CoV) in SARS patients: implications for pathogenesis and virus transmission pathways. J. Pathol. 203, 622–630.

Fehr, A.R., Channappanavar, R., and Perlman, S. (2017). Middle East Respira- tory Syndrome: Emergence of a Pathogenic Human Coronavirus. Annu. Rev. Med. 68, 387–399.

Ge, X.Y., Li, J.L., Yang, X.L., Chmura, A.A., Zhu, G., Epstein, J.H., Mazet, J.K., Hu, B., Zhang, W., Peng, C., et al. (2013). Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503, 535–538.

Gierer, S., Bertram, S., Kaup, F., Wrensch, F., Heurich, A., Kra¨ mer-Ku¨ hl, A., Welsch, K., Winkler, M., Meyer, B., Drosten, C., et al. (2013). The spike protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2, and is targeted by neutralizing anti- bodies. J. Virol. 87, 5502–5511.

Glowacka, I., Bertram, S., Mu¨ ller, M.A., Allen, P., Soilleux, E., Pfefferle, S., Stef- fen, I., Tsegaye, T.S., He, Y., Gnirss, K., et al. (2011). Evidence that TMPRSS2 activates the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein for membrane fusion and reduces viral control by the humoral immune response. J. Virol. 85, 4122–4134.

Gu, J., Gong, E., Zhang, B., Zheng, J., Gao, Z., Zhong, Y., Zou, W., Zhan, J., Wang, S., Xie, Z., et al. (2005). Multiple organ infection and the pathogenesis of SARS. J. Exp. Med. 202, 415–424.

Guan, Y., Zheng, B.J., He, Y.Q., Liu, X.L., Zhuang, Z.X., Cheung, C.L., Luo, S.W., Li, P.H., Zhang, L.J., Guan, Y.J., et al. (2003). Isolation and characteriza- tion of viruses related to the SARS coronavirus from animals in southern China. Science 302, 276–278.

Haga, S., Yamamoto, N., Nakai-Murakami, C., Osawa, Y., Tokunaga, K., Sata, T., Yamamoto, N., Sasazuki, T., and Ishizaka, Y. (2008). Modulation of TNF- alpha-converting enzyme by the spike protein of SARS-CoV and ACE2 in- duces TNF-alpha production and facilitates viral entry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 7809–7814.

Hamming, I., Timens, W., Bulthuis, M.L., Lely, A.T., Navis, G., and van Goor, H. (2004). Tissue distribution of ACE2 protein, the functional receptor for SARS coronavirus. A first step in understanding SARS pathogenesis. J. Pathol. 203, 631–637.

He, Y., Li, J., Heck, S., Lustigman, S., and Jiang, S. (2006). Antigenic and immunogenic characterization of recombinant baculovirus-expressed severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein: implication for vaccine design. J. Virol. 80, 5757–5767.

Hoffmann, M., Mu¨ ller, M.A., Drexler, J.F., Glende, J., Erdt, M., Gu¨ tzkow, T., Lo- semann, C., Binger, T., Deng, H., Schwegmann-Weßels, C., et al. (2013). Dif- ferential sensitivity of bat cells to infection by enveloped RNA viruses: corona- viruses, paramyxoviruses, filoviruses, and influenza viruses. PLoS ONE 8, e72942.

Hofmann, H., Geier, M., Marzi, A., Krumbiegel, M., Peipp, M., Fey, G.H., Gram- berg, T., and Po¨ hlmann, S. (2004a). Susceptibility to SARS coronavirus S pro- tein-driven infection correlates with expression of angiotensin converting enzyme 2 and infection can be blocked by soluble receptor. Biochem. Bio- phys. Res. Commun. 319, 1216–1221.

Hofmann, H., Hattermann, K., Marzi, A., Gramberg, T., Geier, M., Krumbiegel, M., Kuate, S., Uberla, K., Niedrig, M., and Po¨ hlmann, S. (2004b). S protein of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus mediates entry into hepatoma cell lines and is targeted by neutralizing antibodies in infected patients. J. Virol. 78, 6134–6142.

Hofmann, H., Pyrc, K., van der Hoek, L., Geier, M., Berkhout, B., and Po¨ hl- mann, S. (2005). Human coronavirus NL63 employs the severe acute respira- tory syndrome coronavirus receptor for cellular entry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 7988–7993.

Huang, C., Wang, Y., Li, X., Ren, L., Zhao, J., Hu, Y., Zhang, L., Fan, G., Xu, J., Gu, X., et al. (2020). Clinical features of patients infected with 2019 novel coro- navirus in Wuhan (China: Lancet).

Imai, Y., Kuba, K., Rao, S., Huan, Y., Guo, F., Guan, B., Yang, P., Sarao, R., Wada, T., Leong-Poi, H., et al. (2005). Angiotensin-converting enzyme 2 pro- tects from severe acute lung failure. Nature 436, 112–116.

Iwata-Yoshikawa, N., Okamura, T., Shimizu, Y., Hasegawa, H., Takeda, M., and Nagata, N. (2019). TMPRSS2 Contributes to Virus Spread and Immunopa- thology in the Airways of Murine Models after Coronavirus Infection. J. Virol. 93 https://doi.org/10.1128/JVI.01815-18.

Kawase, M., Shirato, K., van der Hoek, L., Taguchi, F., and Matsuyama, S. (2012). Simultaneous treatment of human bronchial epithelial cells with serine and cysteine protease inhibitors prevents severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. J. Virol. 86, 6537–6545.

Kim, T.S., Heinlein, C., Hackman, R.C., and Nelson, P.S. (2006). Phenotypic analysis of mice lacking the Tmprss2-encoded protease. Mol. Cell. Biol. 26, 965–975.

Kleine-Weber,  H.,  Elzayat,  M.T.,  Hoffmann,  M.,  and  Po¨ hlmann,  S.  (2018). Functional analysis of potential cleavage sites in the MERS-coronavirus spike protein. Sci. Rep. 8, 16597.

Kleine-Weber, H., Elzayat, M.T., Wang, L., Graham, B.S., Mu¨ ller, M.A., Dros- ten, C., Po¨ hlmann, S., and Hoffmann, M. (2019). Mutations in the Spike Protein of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus Transmitted in Korea In- crease Resistance to Antibody-Mediated Neutralization. J. Virol. 93 https:// doi.org/10.1128/JVI.01381-18.

Kuba, K., Imai, Y., Rao, S., Gao, H., Guo, F., Guan, B., Huan, Y., Yang, P., Zhang, Y., Deng, W., et al. (2005). A crucial role of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in SARS coronavirus-induced lung injury. Nat. Med. 11, 875–879.

Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., and Tamura, K. (2018). MEGA X: Mo- lecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Mol Biol Evol 35, 1547–1549.

Lau, S.K., Woo, P.C., Li, K.S., Huang, Y., Tsoi, H.W., Wong, B.H., Wong, S.S.,

Leung, S.Y., Chan, K.H., and Yuen, K.Y. (2005). Severe acute respiratory syn- drome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 14040–14045.

Li, W., Moore, M.J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S.K., Berne, M.A., Somasun- daran, M., Sullivan, J.L., Luzuriaga, K., Greenough, T.C., et al. (2003). Angio- tensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426, 450–454.

Li, F., Li, W., Farzan, M., and Harrison, S.C. (2005a). Structure of SARS coro- navirus spike receptor-binding domain complexed with receptor. Science 309, 1864–1868.

Li, W., Zhang, C., Sui, J., Kuhn, J.H., Moore, M.J., Luo, S., Wong, S.K., Huang, I.C., Xu, K., Vasilieva, N., et al. (2005b). Receptor and viral determinants of SARS-coronavirus adaptation to human ACE2. EMBO J. 24, 1634–1643.

Li, W., Hulswit, R.J.G., Widjaja, I., Raj, V.S., McBride, R., Peng, W., Widagdo, W., Tortorici, M.A., van Dieren, B., Lang, Y., et al. (2017). Identification of sialic acid-binding function for the Middle East respiratory syndrome coronavirus spike glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, E8508–E8517.

Lin, J.T., Zhang, J.S., Su, N., Xu, J.G., Wang, N., Chen, J.T., Chen, X., Liu, Y.X.,

Gao, H., Jia, Y.P., et al. (2007). Safety and immunogenicity from a phase I trial of inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccine. Antivir. Ther. (Lond.) 12, 1107–1113.

Liu, W., Fontanet, A., Zhang, P.H., Zhan, L., Xin, Z.T., Baril, L., Tang, F., Lv, H., and Cao, W.C. (2006). Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. J. Infect. Dis. 193, 792–795.

Matsuyama, S., Nagata, N., Shirato, K., Kawase, M., Takeda, M., and Taguchi,

F. (2010). Efficient activation of the severe acute respiratory syndrome corona- virus spike protein by the transmembrane protease TMPRSS2. J. Virol. 84, 12658–12664.

Menachery, V.D., Dinnon, K.H., III, Yount, B.L., Jr., McAnarney, E.T., Gralinski, L.E., Hale, A., Graham, R.L., Scobey, T., Anthony, S.J., Wang, L., et al. (2020). Trypsin treatment unlocks barrier for zoonotic bat coronaviruses infection. J. Virol. 94 https://doi.org/10.1128/JVI.01774-19.

Munster, V.J., Koopmans, M., van Doremalen, N., van Riel, D., and de Wit, E. (2020). A Novel Coronavirus Emerging in China – Key Questions for Impact Assessment. N. Engl. J. Med. 382, 692–694.

Park, J.E., Li, K., Barlan, A., Fehr, A.R., Perlman, S., McCray, P.B., Jr., and Gal- lagher, T. (2016). Proteolytic processing of Middle East respiratory syndrome coronavirus spikes expands virus tropism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113, 12262–12267.

Park, Y.J., Walls, A.C., Wang, Z., Sauer, M.M., Li, W., Tortorici, M.A., Bosch, B.J., DiMaio, F., and Veesler, D. (2019). Structures of MERS-CoV spike glyco- protein in complex with sialoside attachment receptors. Nat. Struct. Mol. Biol. 26, 1151–1157.

Raj, V.S., Mou, H., Smits, S.L., Dekkers, D.H., Mu¨ ller, M.A., Dijkman, R., Muth, D., Demmers, J.A., Zaki, A., Fouchier, R.A., et al. (2013). Dipeptidyl peptidase 4 is a functional receptor for the emerging human coronavirus-EMC. Nature 495, 251–254.

Shieh, W.J., Hsiao, C.H., Paddock, C.D., Guarner, J., Goldsmith, C.S., Tatti, K., Packard, M., Mueller, L., Wu, M.Z., Rollin, P., et al. (2005). Immunohisto-chemical, in situ hybridization, and ultrastructural localization of SARS-associ- ated coronavirus in lung of a fatal case of severe acute respiratory syndrome in Taiwan. Hum. Pathol. 36, 303–309.

Shirato, K., Kanou, K., Kawase, M., and Matsuyama, S. (2016). Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. J. Virol. 91 https://doi.org/10.1128/JVI.01387-16.

Shirato, K., Kawase, M., and Matsuyama, S. (2018). Wild-type human corona- viruses prefer cell-surface TMPRSS2 to endosomal cathepsins for cell entry. Virology 517, 9–15.

Shulla, A., Heald-Sargent, T., Subramanya, G., Zhao, J., Perlman, S., and Gal- lagher, T. (2011). A transmembrane serine protease is linked to the severe acute respiratory syndrome coronavirus receptor and activates virus entry. J. Virol. 85, 873–882.

Simmons, G., Gosalia, D.N., Rennekamp, A.J., Reeves, J.D., Diamond, S.L., and Bates, P. (2005). Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 11876–11881.

Wang, C., Horby, P.W., Hayden, F.G., and Gao, G.F. (2020). A novel coronavi-rus outbreak of global health concern. Lancet 395, 470–473.

WHO (2004). Summary of probable SARS cases with onset of illness from 1 November 2002 to 31 July 2003. https://www.who.int/csr/sars/country/ table2004_04_21/en/.

WHO (2020). Novel Coronavirus(2019-nCoV) Situation Report 23. https:// www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200212-sitrep-23-ncov.pdf?sfvrsn=41e9fb78_4.

Wu, N.H., Yang, W., Beineke, A., Dijkman, R., Matrosovich, M., Baumga¨ rtner, W., Thiel, V., Valentin-Weigand, P., Meng, F., and Herrler, G. (2016). The differ- entiated airway epithelium infected by influenza viruses maintains the barrier function despite a dramatic loss of ciliated cells. Sci. Rep. 6, 39668.

Yamamoto, M., Matsuyama, S., Li, X., Takeda, M., Kawaguchi, Y., Inoue, J.I., and Matsuda, Z. (2016). Identification of Nafamostat as a Potent Inhibitor of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus S Protein-Mediated Mem- brane Fusion Using the Split-Protein-Based Cell-Cell Fusion Assay. Antimi- crob. Agents Chemother. 60, 6532–6539.

Yang, Y., Du, L., Liu, C., Wang, L., Ma, C., Tang, J., Baric, R.S., Jiang, S., and Li, F. (2014). Receptor usage and cell entry of bat coronavirus HKU4 provide insight into bat-to-human transmission of MERS coronavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 12516–12521.

Yang, Y., Liu, C., Du, L., Jiang, S., Shi, Z., Baric, R.S., and Li, F. (2015). Two Mutations Were Critical for Bat-to-Human Transmission of Middle East Respi- ratory Syndrome Coronavirus. J. Virol. 89, 9119–9123.

Yeager, C.L., Ashmun, R.A., Williams, R.K., Cardellichio, C.B., Shapiro, L.H., Look, A.T., and Holmes, K.V. (1992). Human aminopeptidase N is a receptor for human coronavirus 229E. Nature 357, 420–422.

Zhou, Y., Vedantham, P., Lu, K., Agudelo, J., Carrion, R., Jr., Nunneley, J.W., Barnard, D., Po¨ hlmann, S., McKerrow, J.H., Renslo, A.R., and Simmons, G. (2015). Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Res. 116, 76–84.

Zhou, P., Yang, X.L., Wang, X.G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., Si, H.R., Zhu, Y., Li, B., Huang, C.L., et al. (2020). A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. https://doi.org/10.1038/ s41586-020-2012-7.Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Li, X., Yang, B., Song, J., Zhao, X., Huang, B.,Shi, W., Lu, R., et al. (2020). A Novel Coronavirus from Patients with Pneumoniain China, 2019. N Engl J Med. 382, 727–733.