Повторна инфекция не може да възникне при резус макаци веднъж инфектирани със SARS-CoV-2

Linlin Bao, Wei Deng, Hong Gao, Chong Xiao, Jiayi Liu, Jing Xue, Qi Lv, Jiangning Liu, Pin Yu, Yanfeng Xu, Feifei Qi, Yajin Qu, Fengdi Li, Zhiguang Xiang, Haisheng Yu, Shuran Gong, Mingya Liu, Guanpeng Wang, Shunyi Wang, Zhiqi Song, Wenjie Zhao, Yunlin Han, Linna Zhao, Xing Liu, Qiang Wei, Chuan Qin

doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.13.990226

Източник: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.13.990226v1.full

© Превод: Боян Велев

Резюме

Епидемия на Коронавирусното Заболяване 2019 (COVID-19), причинено от Коронавирусния Тежък Остър Респираторен Синдром – 2 (ТОРС-КоВ-2, англ. език: SARS-CoV-2) започва в Ухан и се разпространява в световен мащаб. Наскоро, се съобщи за пациенти от Китай и други места, които са дали положителни проби, след като вече са прекарали инфекцията и са били изписани. Въпреки това, остава неясно дали възстановяващите се пациенти са изложени на риск от рецидив и повторна инфекция. Това проучване разглежда надлъжно проследяване на повторно експозиция на вируса, на заразени маймуни, при които симптомите на SARS-CoV-2 са вече преминали. Установихме, че загуба на тегло при някой от маймуните, вирусна репликация предимно в носа, фаринкса, белите дробовете и червата, както и умерена интерстициална пневмония на 7-я ден след инфекцията (dpi – days post-infection) са ясно изразени при маймуните резус след първоначалната им инфекция. След облекчаване на симптомите и положителен тест за съответни антитела, половината от заразените маймуни бяха изложени повторно на същата доза от щама на SARS-CoV-2. Отявлено, при тези повторно изложени маймуни не се установи нито вирусно натрупване в назофарингеалните и анални натривки взети през определен период нито вирусна репликация във всички основни тъкани на 5-я ден от повторното заразяване (dpr – days post-reinfection). В комбинация с последващите вирусологични, рентгенологични и патологични заключения, маймуните с повторна експозиция не показват рецидив на COVID-19, подобно на заразените маймуните без повторна експозиция. Взети заедно, нашите резултати показват, че първичното инфектиране със SARS-CoV-2 може да предпази от последващи експозиции; това има отношение към прогнозирането на болестта и е ключово при създаването на ваксина.

Коронавирусното заболяване 2019 (COVID-19), причинено от Коронавирусния Тежък Остър Респираторен Синдром – 2 (ТОРС-КоВ-2, англ. език: SARS-CoV-2) възникнало в провинция Ухан, Китай продължи своето разпространение в Южна Корея, Япония, Италия и Иран. Повече от 90 000 души са заразени в световен мащаб, с близо 3000 смъртни случая в около 40 държави 1,2. От Февруари насам, случаите на изписани, в провинция Гуандонг и на други места пациенти, показали положителни проби и трябвало да се хоспитализират за наблюдение се оценяват на около 14% 3,4.  Съмненията за риск от рецидив и повторна инфекция след възстановяване от първоначалната инфекция будят световно притеснение. По тази причина, в това изследване, сме използвали примерите на SARS-COV-2 инфекция при нечовешки примати, последвани от повторна експозиция на същия вирус, за да се установи вероятността от повторна инфекция.

Четири възрастни китайски макака резус (№ М1 – М4, 3-5кг, 3-5 год.) са интратрахеално изложени на SARS-COV-2 at 1×106 50% tissue-culture infectious doses (TCID50), като по график (Фигура 1) са следени телесното им тегло, телесната температура, правени са ренгенови снимки, вземани са серумни проби, назални/гърлени/анални натривки и всички основни тъкани. След първоначалната инфекция, 3 от 4те маймуни показват загуба на тегло в рамките на 200 до 400гр. (Фигура 2а), но не се наблюдава промяна в ректалната температура при нито една от всичките четири (Фигура 2b). Други клинични показания, след първоначалното излагане, като намаляване на апетита, увеличаване честотата на дишане и прегърбена стойка са преходни/краткотрайни. После, по график след инфекцията, определихме вирусните натрупвания в респираторните и анални натривки. Както се вижда на Фигури 2с и 2d, вирусното натрупване в пробите от назалните и фарингеалните натривки достигат най-високите си нива (средно, около 6.5 log10 РНК копия/mL) на 3-я ден след инфекцията (dpi), след което намаляват естествено. Подобно, вирусното натрупване при аналните проби достига пик от около 4.5 log10 РНК  копия/mL на 3-я ден след инфекцията (dpi), след което на 14-я ден след инфекцията (dpi) спада до недоловими нива (Фигура 2е). За да се установи вирусното разпространение и хистопатологичните промени в инфектираните със SARS-COV-2 маймуни, М1 маймуна бива евтаназирана и подложена на аутопсия на 7-я ден (dpi). Както се вижда на Фигура 2f (ляв панел), вирусна репликация е открита в носа (107 до 108 копия/mL), фаринкса (105 до 106 копия /mL), белите дробове (104 до 107 копия /mL), червата (104 до 106 копия /mL), гръбначния мозък (приблизително 104 копия /mL), сърцето (приблизително 104 копия /mL), скелетните мускули (приблизително 104 копия /mL) и пикочния мехур (приблизително 104 копия /mL). При това, лезиите възникнали основно в белите дробове потвърдени с хематоксилин/ еозин оцветени натривки и анти S-протеин (anti ACE2-rezetor) оцветяване, на пробите се открива  лека до средна интерстициална пневмония характеризираща се удебелени алвеоларни септи, натрупване на алвеоларни макрофаги в алвеолите, дегенерация на алвеоларния епител и  с инфилтрация на възпалителни клетки (Фигура 3а). В допълнение, рентгенът на бял дроб, на 7-я ден dpi, показва в различна степен изразени инертстициални инфилтрати в горния дял на десния бял дроб, от леки до двустранни промени тип матово стъкло (М4, Фигура 3b).

За надлъжно проследяване на характеристиките при всяка маймуна, специфичните антитела срещу SARS-CoV-2 на маймуни М2, М3 и М4 бяха значително завишени на 14-я или 21-я и 28шя ден pdi в сравнение с тези на 3-я и 7-я ден dpi (*P<0.05, **P<0.01, Фигура 2g). При трите живи маймуни, телесното тегло и ректалната температура остават сравнително стабилни преди повторно излагане (Фигури 2а и 2b), вирусното натрупване в назофарингиалните и анални натривки, вземани по установения график, не са откриват преди 28-я ден dpi (Фигури 2с до 2е), както и не са забелязват при рентген на гръдния кош на 28-я ден преди повторното излагане. (Показва се от M4, Фигура 3b). Като цяло, тези данни показват, че трите животни могат да се смятат за възстановяващи се от SARS-CoV-2 инфекция, като също така покриват критериите за изписване (липса на клинични симптоми, рентгенологични отклонения и 2 негативни RT-PCR резултата 5 )

Фигура 1: План на експеримента и график за събиране на пробите

Четири маймуни са първоначално изложени на 1×106 TCID50 SARS-CoV-2 през интратрахеален метод. За да се изследва влиянието на повторната инфекция, след като са се възстановили М3 и М4 са изложени на същата доза SARS-CoV-2 на 28-я ден след инфекцията (dpi). Две от животните (М1 и М3) са евтаназирани съответно на 7-я и 5-я ден след повторното излагане (dpr). M2 с единична инфекция и М4 с основна инфекция последвани от вторичното излагане са надлъжно проследявани през целия период на наблюдението. Телесното тегло, температура и назални/гърлени/анални натривки са следени на кратки интервали по график. Две измервания на разпространение на вируса и хистопаталогия (HE/IHC stain) са направени на 7-я ден dpi (М1) и 5-я ден dpr (М3). Специфичните антитела срещу SARS-CoV-2 са установени седем пъти а рентгеново изследване е правено 3 пъти.

Фигура 2: надлъжно проследявани на клиничните признаци, вирусната репликация и имунния отговор

(a и b) Клинични признаци при всяка маймуна. Ежедневно са записвани промените в показателите на телесното тегло и ректалната температура според графика след първоначалната инфекция и последвалата повторна експозиция на вируса. Теглото е представено като процент от телесеното тегло преди инфекцията.

(c, d и e) Установени нива на вирусна РНК в назалните натривки, гърлените натривки и аналните натривки. SARS-CoV-2 РНК е установена чрез qRT-PCR на натривките от четирите маймуни, в съответните моменти. Две маймуни са повторно изложени на вируса на 28-я ден dpi (пунктирана линия)

(f) Установяване на вирусно РНК в основните органи, като мозък, очи, нос, фаринкс, бели дробове и черва. В сравнение с М1 с първоначална инфекция на 7-я ден dpi, тестовете за вирусна репликация в съответните тъкани при М3 (на 5ти ден dpr) след повторно излагане са отрицателни.

(g) НИва на специфичен IgG спрямо spike-протеина при всяка маймуна. Нивата на специфичния анти-вирусни антиген IgG от всяка маймуна са установени на 3, 7,14,21,28-я дни dpi. Нивата на специфичния IgG на 14-я, 21-я или 28-я ден dpi са значително по-високи спрямо тези на 3-я или 7-я ден dpi. Сивите линии илюстрират средната стойност за всички животни в съответния момент. (One-way ANOVA, *P<0.05, **P<0.01)

Фигура 3: надлъжно проследяване при хистопатологията и рентгена на гръдния кош

(a) Хистопатологията и имунохистохимичните изследвания на белите дробове на маймуна М1 (7-ми ден dpi) и маймуна М3 (5-ти ден dpr). Хистопатологичното изследване показа умерена интерстициална пневмония с инфилтрация на лимфоцитите (зелена стрелка) и подути алвеоларни макрофаги (червена стрелка) в алвеоларните кухини на 7-я ден dpi. Антигените на SARS-KoV-2 са отчетени с анти-Spike антитела чрез имунохистохимично изследване. Мащаб: Черна лента = 100 µm, червена лента = 50 µm

 (b) Надлъжното изследване на гръден рентген на маймуна М4. Маймуна М4 е подложена на рентген на гръдния кош преди излагане с вируса, както и след това на 7-а, 28-я ден dpi и на 5-я ден dpr. Предни рентгенови снимки (горен ред), странични рентгенови снимки (долен ред). В последствие, две от вече инфектираните маймуни (М3 и М4) са подложени на повторно излагане на вируса – интратрахеално, на 28-я ден dpi и със същата доза (1×106 TCID50) от SARS-CoV-2, за да се установи вероятността от повторна инфекция,  докато маймуна М2, без други манипулации, остава под постоянно наблюдение като контролен обект (Фигура 1). При нито една от маймуните не се наблюдава загуба на тегло след повторната експозиция (Фигура 2а), но се наблюдава моментно повишаване на телесната температура и при двете маймуни подложени на повторна експозиция. (Фигура 2b). Назофарингеалните и аналните натривки, по време на обследването, дават отрицателни резултати за вирусни натрупвания след повторната експозиция на SARS-CoV-2 (Фигури 2c до 2e). Съответно, маймуна М3 е евтаназирана и й е направена аутопсия на 5-я ден след повторното инфектиране (dpr), за да се потвърди вирусната репликация и хистопатологичните промени причинени от повторната експозиция. В сравнение с маймуна М1 на 7-я ден dpi, при маймуна М3, на 5-я ден dpr, не се открива вирусна репликация във всички тъкани (Фигура 2f, дясно), както и никакви патологични увреждания и вирусни антигени и тъканите на белите дробове (Фигура 3а, долу). Както се вижда на Фигура 3b, рентгена на гръдния кош не показва наличие на аномалии при маймуна М4 на 5-я ден dpr, както и преди повторната експозиция (на 28-я ден dpi). Следователно, нашите резултати показват, че маймуните със SARS-CoV-2 инфекция, не могат да се ре-инфектират със същия щам, след като веднъж са се възстановили след него. Надлъжно, маймуната преминала само едно инфектиране в рамките на това изследване също не показа наличието на рецидиви след възстановяването си.

Съобщава се, че високите нива на неутрализиращи антитела имат защитен ефект от SARS-CoV инфекцията, но ниските нива са неутрализиращи антитела са по-податливи и могат да засилят SARS-CoV инфекцията, предизвиквайки ефект на улеснено Антитяло зависимо навлизане в клетката гостоприемник (ADE) 6. Като се вижда на Таблица 1, титрите от 1.16 (М2,М4) и 1.8 (М3) показват неутрализиращ ефект при 21-я и 28-я ден dpi. След повторната експозиция, титрита на М4 се увеличават на 5-я ден dpr и 14-я ден dpr, докато тези на М3 остават на 1.8 на 5-я ден dpr. В това изследване, не е установен ADE при инфектираните маймуни, които след това са подложени на експозиция със SARS-CoV-2. Тъй като неутрализиращото антитяло от нашите изследване върху животни  е подобно на това при възстановили се пациенти, тези резултати  ще имат важно значение при оценката за развитието на ваксина.

Table 1 : Титри с неутрализиращи антитела предпазващи от инфектираните със SARS-CoV-2-маймуни от повторно заразяване.

Според настоящото ни надлъжно проучване на маймуни реинфекция не би могла да възникне, ако маймуните произвеждаха неутрализиращи антитела в един ранен етап след първоначалната инфекция. Съответно, възстановяващите се пациенти няма да бъдат заразни, когато изграждат достатъчно специфични антитела, за да развият имунитет към SARS-CoV-2. От друга страна, при маймуните с повторна експозиция не се открива вирусна репликация в никои основни тъкани, което предполага, че коронавирусът не може да бъде скрит за дълго време. Относно „феномена“ излекувани пациенти да дават положителни проби, това може да се дължи на „лъжливо отрицателни“ RT-PCR резултати от теста, преди изписване на пациентите или при пациенти, които все още не са напълно оздравели, макар и да отговарят на критериите за изписване. Следователно, допълнително  шлифоване на диагностичните техники, наблюдение за антитела и тестване на проби от долните дихателни пътища, са ключови за излекуването на SARS-CoV-2 инфекцията. С това проучване, нашите резултати показват, че първична инфекция със SARS-CoV-2 може да предпази при последващи експозиции, което може да послужи като прогноза за развитие на заболяването и да има основополагащо влияния върху изработката на ваксина. Много е важно, че неуспешното повторно заразяване според статистическия модел за разработване на нови продукти (NHP),  предполага, че повторно положителните резултати при изписани не следва да се дължи на ре-инфекция. Трябва да се разгледат по-сложни въпроси, за да се установят причините.

Използвани Методи:

Етичност

Четири 3 до 5 годишни резус макака, с имена М1 до М4 са подслонени и обгрижвани в съоръжение акредитирано от Асоциацията за Оценка и Акредитация на Грижи за Лабораторни Животни (AAALAC). Всички процедури и експерименти свързани с животните са извършени в съответствие с правилата одобрени от Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the Institute of Laboratory Animal Science, Китайска Академия за Медицински Науки (BLL20001). Всички животни анестезирани с кетамин хидрохлорид (10 mg/kg) преди вземането на проби, а експериментите са проведени в лаборатория с ниво 3 на животинска био-безопасност (ABSL3).

Експерименти с животни

При първоначалното инфектиране, всички животни са впръскани интратрахеално с наличния вирус SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN изолиран в нашата лаборатория), при дозировка 106 TCID50/1 mL от разтвора. След възстановяването си, М3 и М4 са подложени на повторна експозиция интратрахеално със същата доза (106 TCID50/1 mL) от SARS-CoV-2 на 28-я ден dpi. За да се потвърди разпространението на вируса и патологичните промени, М1 и М3 са евтаназирани и им е направена ауто аутопсия съответно на 7-я де dpi и 33-я ден dpi (5-ти ден dpr). Всички животни са наблюдавани през времето на изследването, за да се регистрират тяхното телесно тегло, телесна температура, клинични признаци, назален / гърлен / анален натривки, рентген и специфичните антитела. Експериментът с животните и графикът за надлъжното вземане на проби са показани на Фигура 1.

Количествено определяне на РНК на SARS-CoV-2

Пробите от назални / гърлени / анални натривки и основните тъкани, събрани от инфектирани маймуни, са тествани за SARS-CoV-2 РНК чрез количествена обратна транскрипция в реално време-PCR (qRT-PCR). Цялостната РНК е извлечена и е направена обратната транскрипция, както е описано по-горе в статията 7. qRT-PCR реакциите са проведени в ABI 9700 PCR система в реално време (Applied Biosystems Instrument), със протокол за температурно секвентиране на ДНК§ РНК  с  PCR съответно на: 50 ° С за 2 минути, 95 ° С за 2 минути, последвано от 40 цикъла при 95 ° C за 15 сек. и 60 ° C за 30 сек, след това 95 ° C за 15 сек, 60 ° C за 1 мин, 95 ° C за 45 сек. Forward primer: 5′-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3 ‘, Reverse primer: 5′-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’.

ELISA

Серуми се събирани от всяко животно за измерване на антителата на SARS-CoV-2 чрез ензимно свързан имуносорбентен тест (ELISA) според графика за тестване след първоначалната инфекция. 96-гнездови плаки са покрити с 0.1 μg  S- protein (ACE2 рецептор) от SARS-CoV-2 (Sino Biological, 40591-V08H) и престояват за една нощ при 4° С и са блокирани с 2% BSA / PBST в продължение на 1 час при стайна температура. Разредени проби 1: 100 са прибавени към всяко гнездо и престояват в продължение на 30 минути при 37° С, последвано от добавяне на човешки антитела HPR IgG Antibody (на фирмата Beijing ZSGB Biotechnology, ZB-2305), инкубирани в продължение на 30 минути при стайна температура, Реакцията е развита от TMB субстрат и определена при 450 nm.

Хистопатология и имунохистохимия

Аутопсиите са извършени съгласно стандартния протокол в лаборатория ниво ABSL3, при 7-я ден dpi за M1 и 5-я ден dpr за M3. Пробите от белите дробове са фиксирани в 10% неутрално-буферен формалинов разтвор. След това са подготвени парафинови сечения (с дебелина 3-4 μm) и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) преди да бъдат наблюдавани чрез светлинна микроскопия. За да се идентифицират антигените на SARS-CoV-2 чрез оцветяване на имунохистохимия (IHC), парафиновите дехидратирани участъци (с дебелина 3-4 цт) са обработени с комплект за извличане на антигенени (Boster, AR0022) за 1 мин. при 37 ° С и са обработени с  ендогенни пероксидази в 3% Н202 в метанол за 10 минути. След фиксирането в 1% нормален кози серум  за 1 час при стайна температура, парчетата са оцветени с 7D2 моноклонално антитяло (лабораторена заготовка7) при 4° С в продължение на една нощ, след инкубиране на човешки антитела HPR  с миши IgG Antibody (Beijing ZSGB Biotechnology, ZDR-5307) за 1 час. След това, парчетата, слайзовете са обработени с с 3,30-диаминобензидин тетрахидрохлорид (DAB) и изображението е разгледано под микроскоп Olympus.

Тест за неутрализиращи антитела

Серумните проби са тествани за наличието на неутрализиращи анти-тела наблюдавани за цитопатични ефекти (СРЕ). На кратко, серумите от маймуните са топлинно-инактивирани при 56°C за 30мин. След това, серийно двукратно разредени серуми са инкубирани със 100 TCID50 SARS-CoV-2 за 1 ч. при 37°C, и прибавени към клетки Vero-E6 в ELISA  96 гнездова платка . Клетките са култивирани за 1 седмица в търсене на  СРЕ и е пресметнато разреждането на серума, при който 50% от клетките са защитени от ингфекция. Всяко разреждане на серума е тествано в три екземпляра.

Статистически анализ

Сравнението между групите е определено използвайки One-way ANOVA. Всички данни са анализирани с GraphPad Prism 8.0 software. Установеното ниво на статистическа значимост  е *p<0.05, **p<0.01.

АВТОРИ

Conceptualization: C.Q.; Methodology: L.B., W.D., H.G., C.X., J.L., J.X. and Q.L.; Investigation: L.B., W.D., H.G., C.X., J.L., J.X., Q.L., J.L., P.Y., Y.X., F.Q., Y.Q., F.L., Z.X., H.Y., S.G., M.L., G.W., S.W., Z.S., W.Z., Y.H., L.Z., X.L. and Q.W.; Writing – Original Draft: J.X.; Writing –Review and Editing: C.Q.; Funding Acquisition: C.Q. and L.B.; Resources: C.Q.; Supervision: C.Q.

КОНФЛИКТ НА ИНТЕРЕСИ

Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

ПРИЗНАНИЯ

Тази разработка е подкрепена от инициативата CAMS за Иновативна Медицина в Китай (Grant No. 2016-I2M-2-006), Национални Мега проекти на Китай за Значителни Инфекциозни Заболявания (2017ZX10304402) и Проект на Китай за Ключови Национални научни Изследвания и Разработки (Grant No. 2016YFD0500304).

ЛИТЕРАТУРА

  1. Zhu N, Zhang D, Wang W, et al. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med 2020:10.1056/NEJMoa2001017.
  2. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) Situation Report. 2020. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200311-sitrep-51-covid-19.pdf?sfvrsn=1ba62e57_4.)
  3.  Lan L, Xu D, Ye G, et al. Positive RT-PCR Test Results in Patients Recovered From COVID-19. JAMA 2020.
  4.  Zhou L, Liu Q, Liu HG. Novel coronavirus pneumonia patients’ recurrence after discharge: Causes Analysis and treatment strategies. Chin J Tubere Respir Dis 2020;43.
  5.  Diagnostic and treatment protocol for Novel Coronavirus Pneumonia (Trial version 7). 2020. at http://www.nhc.gov.cn/yzygj/s7652m/202003/a31191442e29474b98bfed5579d5af95.shtml).
  6.  Wang SF, Tseng S-P, Yen C-H, et al. Antibody-dependent SARS coronavirus infection is mediated by antibodies against spike proteins. Biochemical & Biophysical Research Communications; 451:20814.
  7.  Bao L, Deng W, Huang B, et al. The Pathogenicity of SARS-CoV-2 in hACE2 Transgenic Mice. bioRxiv 2020:2020.02.07.939389.