Инхалаторният кортикостероиден циклезонид блокира репликацията на коронавирусната РНК чрез насочване към вирусния NSP15

Източник: https://doi.org/10.1101/2020.03.11.987016

Превод: Боряна Маринкова

Това е предпечат и не е преминал редакторска проверка

Shutoku Matsuyama, Miyuki Kawase, Naganori Nao, Kazuya Shirato, Makoto Ujike, Wataru Kamitani, Masayuki Shimojima, Shuetsu Fukushi

Резюме
Стероидните съединения, които се очаква да имат двойни функции за блокиране на възпалението на гостоприемника и репликацията на MERS-CoV, бяха обект на химически анализ. В рамките на анализа се оказа, че циклезонид, инхалационен кортикостероид, потиска репликацията на човешки коронавирус в култивирани клетки, но не потиска репликацията на респираторен синцитиален вирус или грипен вирус. Ефективната концентрация на циклезонид за блокиране на репликацията на SARS-CoV-2 (причинител на COVID-19) (EC90) е 6,3 µM. След единадесетия поред MERS-CoV пасаж в среда с циклезонид се генерира резистентна мутация, която води до заместване на аминокиселина (A25V) с неструктурен протеин (NSP) 15, както е идентифицирано чрез реверсивна генетика. Рекомбинантният вирус с мутация също е устойчив на потискане с циклезонид при вирусна репликация. Тези наблюдения предполагат, че ефектът на циклезонид е специфичен за коронавирус, което предполага, че това е лекарство кандидат за лечение на пациенти, страдащи от MERS или COVID-19.
Въведение
Пандемията на COVID-19 започна на декември 2019 г. в Ухан, Китай (1), а вирусътSARS-CoV-2, бързо се разпространи в 43 страни към 27 февруари 2020 г. Броят на заразените пациенти надхвърля 81 000, смъртността надхвърля 2700 души. Съобщава се, че няколко лекарства, включително лопинавир, ремдезивир и хлорохин, са предполагаемо ефективни при лечение на това заболяване (2, 3).
Системното лечение с кортикостероиди е противопоказано при тежка пневмония, причинена от вируси като MERS-CoV и SARS-CoV, тъй като стероидите потискат имунната система, което води до повишена репликация на вируса. Всъщност при SARS през 2003 г. и MERS през 2013 г. лечението с кортикостероиди се свързва с повишена смъртност (4, 5). В настоящото проучване преразглеждаме употребата на инхалаторни кортикостероиди, които са изключени от лечението на пневмония, причинена от коронавирус.
Резултати и обсъждане
Стероидните съединения, които се очаква да имат двойни функции за блокиране както на коронавирусната репликация, така и на възпалението при гостоприемника, бяха изследвани чрез химически анализ. Цитопатичният ефект, причинен от MERS-CoV инфекцията, се измерва за оценка на вирусна репликация. Четири стероидни съединения, циклезонид, мометазон фуроат, мифепристон и алгестонов ацетофенид дават по-голяма от 95% степен на оцеляване на клетките (фиг. S1).
По-нататък се оценява зависимото от концентрация потискане на вирусен растеж и лекарствената цитотоксичност. Циклезонидът проявява ниска цитотоксичност и мощно потискане на вирусен растеж (фиг. 1а). Кортизон и преднизолон, които обикновено се използват за системно стероидно лечение, дексаметазон, който има силни имуносупресивни ефекти, и флутиказон, често използван инхалаторен стероид, не потискат растежа на вируса (фиг. 1а).

Фигура 1: Антивирусни ефекти на стероиди върху MERS-CoV инфекцията.

а) Ефект на стероидите върху репликацията на MERS-CoV. Веро клетките се инфектират с MERS-CoV при MOI = 0.01 в присъствието на стероиди за 24 часа. Вирусният титър в клетъчния супернатант се определя количествено чрез стандартен анализ на плаки, използвайки Vero / TMPRSS2 клетки. Клетъчната жизнеспособност в присъствието на стероиди се определя количествено чрез WST анализ на 24 часа след инфекцията (hpi). (б) Циклезониден мутант. Веро клетките, третирани с циклезонид, са заразени с парентални MERS-CoV или с мутант на циклозонид. Вирусният титър се измерва, както е описано в панел a. (в) Vero клетките бяха заразени с щам MERS-CoV / EMC (Re-EMC / MERS) или рекомбинантния мутант щам (Re-Nsp15-A25V) с заместване на аминокиселина при A25V в NSP15. Вирусният титър се измерва, както е описано в панел a.
Антивирусните ефекти на стероидите срещу различни видове вируси са тествани чрез количествено определяне на размножен вирус в културална среда. Циклезонид и мометазон също потискат репликацията на други коронавируси, HCoV-229E и SARS-CoV, но не и репликация на RS вирус или грипен вирус (фиг. S2). В допълнение циклезонидът леко, но значително инхибира репликацията на вируса на рубеола (имащ положителен РНК геном) (фиг. S2), което предполага, че циклезонид взаимодейства с мястото на репликация на РНК вируса с положителна верига вътреклетъчно.
За да идентифицираме лекарствената цел на репликация на вируса, проведохме 11 последователни пасажи на MERS-CoV в 40 µM циклезонид или 40 µM мометазон. Генериран е мутант вирус, който развива резистентност на циклезонид (фиг. 1б), но не се генерира резистентен вирус към мометазон. Следващото поколение последователност идентифицира, че заместване на аминокиселина при A25V (C19647T в референтната последователност NC_019843.3) в неструктурен протеин 15 (NSP15), коронавирус ендорибонуклеаза (6–8), е прогнозираният механизъм за вирусна резистентност към циклезонид. Рекомбинантният вирус, носител на заместената аминокиселина A25V (Re-Nsp15-A25V), се генерира от щам MERS-CoV / EMC (Re-EMC / MERS) с BAC реверсивна генетична система (9), който преодоля антивирусния ефект на циклезонид (фиг. 1в). Интересното е, че мутантният вирус е инхибиран от мометазон, което предполага, че антивирусната цел на мометазона е различна от тази на циклезонид.

След това се оценява ефектът на циклезонид върху инфекцията на SARS-CoV-2. VeroE6 / TMPRSS2 клетките (10) бяха заразени с автентичен SARS-CoV-2 в присъствието на стероиди или други инхибитори. 6 часа след заразяването се изолира клетъчната РНК и се провежда PCR в реално време, за да се определи количеството на вирусна РНК (11). Циклезонид и мометазон потискат вирусната репликация с подобна ефикасност като лопинавир (фиг. 2а). За сравнение бяха тествани инхибитори на навлизане на вирусни клетки. E64d значително намали нивата на вирусна РНК, но нафамостат и камостат имаха скромна антивирусна ефективност, което предполага, че SARS-CoV-2 използва предимно катепсин / ендозомния път на навлизане в клетката, а не TMPRSS2 / клетъчната повърхност, за да навлезе в клетки, експресиращи TMPRSS2, което е в съответствие с неотдавнашно проучване (12). Циклезонид блокира репликацията на SARS-CoV-2 при ниски концентрации (EC50 =□4.4□μM; EC90□=□6.3□μM; CC50□>□100□μM) (Фиг. 2b).

Фигура 2: Антивирусен ефект на стероидите върху SARS-CoV-2.

(a) Вътреклетъчна SARS-CoV-2 РНК (6 hpi). Клетките VeroE6 / TMPRSS2 бяха инфектирани с SARS-CoV-2 при MOI = 1 в 10 µM съединения в продължение на 6 часа. Клетъчната вирусна РНК се определя количествено чрез PCR в реално време, използвайки Е генен праймер.
(b) (б) Културална среда на РНК на SARS-CoV-2 (27 hpi). Клетките VeroE6 / TMPRSS2 бяха инфектирани с SARS-CoV-2 при MOI = 0.01 в циклезонид в продължение на 27 часа. Вирусната РНК в културална среда беше количествено определена чрез PCR в реално време, използвайки Е генен праймер. Клетъчната жизнеспособност в циклезонид се определя количествено при 27 hpi чрез WST анализ.

Това проучване предполага, че вероятно циклезонидът взаимодейства с вирусен NSP15, пряко или косвено, за да потисне вирусна репликация на SARS-CoV-2. Замяната на аминокиселина в мутанта, устойчив на циклезонид, разположен на мястото на димеризация на NSP15 хомо-хексамер (12), предполага, че циклезонид взаимодейства с NSP15 по време на вирусна биогенеза. Бъдещите изследвания ще предоставят подробен анализ на молекулярните механизми на потискане на циклезонид при репликация на вируса.
Циклезонид е безопасно лекарство и може да се прилага на кърмачета във високи концентрации. Очаква се инхалаторният циклезонид да намали репликацията на вируса и възпалението в белите дробове на гостоприемника, с понижени имуносупресивни ефекти в сравнение със системните кортикостероиди, тъй като циклезонид основно остава в белодробната тъкан и не навлиза значително в кръвообращението. Лечението на пациенти с циклезонид трябва да бъде внимателно оценено, като се вземе предвид балансът полза-риск от лекарството.


Материали и методи

Клетки и вируси
Vero клетки и VeroE6 клетки, експресиращи TMPRSS2 (VeroE6 / TMPRSS2) се поддържат в модифицираната среда на Eagle на Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich, САЩ), допълнена с 5% фетален говежди серум (Gibco-BRL, САЩ). MERS-CoV и SARS-CoV-2 се размножават във Vero и VeroE6 / TMPRSS2 клетки.
Стероиди и инхибитори
Използвани са следните съединения: кортизон, преднизолон, флутиказон, дексаметазон, алгестонов ацетофенид, мифепристон, мометазон фуроат и циклесонид (от Prestwick of Chemical Library; PerkinElmer, МА, САЩ), нафмостат (N0289; Sigma), томокрит (N0289; Sigma), камостат (310); Bioscience, САЩ), E64d (330005; Calbiochem, САЩ) и лопинавир (SML1222; Sigma).
Quantification of coronaviral RNA
Съединените клетки в 96-ямкови плаки се инокулират с вирус в среда на стероидни съединения. Клетъчната РНК се изолира на 6 часа след заразяването (hpi), използвайки CellAmp Direct RNA Prep Kit (3732; Такара, Япония) и културалната среда при 24 hpi или 27 hpi се разрежда 10 пъти във вода, след което се кипва. Извършва се PCR анализ в реално време, за да се определи количеството на коронавирусната РНК с MyGo Pro инструмент (IT-IS Life Science, Ирландия), като се използват праймери, описани по-рано (11, 13).
Анализ на цитотоксичността
Съединените клетки в 96-ямкови плаки бяха третирани със стероиди. След инкубиране за 24 или 27 часа, се провежда анализ на жизнеспособността на клетките с помощта на WST реагент (CK12; Dojin Lab, Япония), съгласно инструкциите на производителя.
Генериране на рекомбинантни MERS-CoV от BAC плазмиди
Клон на бактериална изкуствена хромозома (BAC), носещ инфекциозен геном в цяла дължина на щама MERS-CoV EMC2012, се използва за генериране на рекомбинантно MERS-CoV, както е описано по-горе (9).
Статистически анализ
Статистическата значимост беше оценена с помощта на ANOVA тест. P-стойност <0,05 се счита за статистически значима. На фигурите значимостта е посочена, както следва: n.s., не значимо; * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; и *** P ≤ 0,001. Грешките са при стандартни отклонения (SD).

Приноси на авторите

S.M., M.S., и S.F. са автори на дизайна на проучването; S.F. направи преглед за лекарствата; S.M., M.K., K.S., и M.U. проведоха експериметите; N.N. извърши NGS; W.K. проведе реверсивна генетика; S.M. написа статията.
Авторите нямат конфликт на интереси.

Признания и благодарности

Благодарим на Tsuneo Morishima от Медицински университет Aichi Medical за полезните предложения. Благодарим и на Ron A. M. Fouchier и Bart L. Haagmans от Медицински център Erasmus за предоставяне на MERS-CoV, и на John Ziebuhr от Университета във Вюрцберг за предоставяне на SARS-CoV. Проучването се извърши с подкрепата на Grants-in Aid от Японската агенция за медицински изследвания и развитие (AMED) (Grant Number JP19fk0108058j0802), и от Японското дружество за насърчаване на наук (JSPS) (Grant Number 17K08868).

Литература

1. X. Ma, et al., A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. 1–7 (2020).
Google Scholar
2.↵H. Lu, Drug treatment options for the 2019-new coronavirus (2019-nCoV). Biosci. Trends A 01020, 10–12 (2020).
Google Scholar
3.↵M. Wang, et al., Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res., 2019–2021 (2020).
Google Scholar
4.↵S. H. Alfaraj, et al., Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection□: A cohort study. 29, 48–50 (2019).
Google Scholar
5.↵N. Lee, et al., Effects of early corticosteroid treatment on plasma SARS-associated Coronavirus RNA concentrations in adult patients. J. Clin. Virol. 31, 304–309 (2004).
CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
6.↵J. Athmer, et al., In Situ Tagged nsp15 Reveals Interactions with Coronavirus Associated Proteins. MBio 8, 1–14 (2017).
CrossRefGoogle Scholar
7.X. Deng, et al., Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNA sensors and limits apoptosis in macrophages. PNAS 114, E4251–E4260 (2017).
Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
8.↵ Lundin, et al., Targeting Membrane-Bound Viral RNA Synthesis Reveals Potent Inhibition of Diverse Coronaviruses Including the Middle East Respiratory Syndrome Virus. PLoS Pathog. 10(2014).
Google Scholar
9.↵Y. Terada, K. Kawachi, Y. Matsuura, W. Kamitani, MERS coronavirus nsp1 participates in an efficient propagation through a specific interaction with viral RNA. Virology 511, 95–105 (2017).
Google Scholar
10.↵S. Matsuyama, N. Nao, K. Shirato, M. Kawase, S. Saito, Enhanced isolation of the novel 2019 coronavirus by TMPRSS2-expressing cells. Submitt. Publ. PNAS (2020).
Google Scholar
11.↵V. M. Corman, et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 25, 1–8 (2020).
Google Scholar
12.↵L. Zhang, et al., Structural and Biochemical Characterization of Endoribonuclease Nsp15 Encoded by Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus. J. Virol. 92, 1–16 (2018).
Google Scholar
13.↵K. Shirato, M. Kawase, S. Matsuyama, Middle East respiratory syndrome coronavirus infection mediated by the transmembrane serine protease TMPRSS2. J. Virol. 87, 12552–61 (2013).
Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar