Одобрено от FDA лекарство Ивермектин инхибира репликацията на SARS-CoV-2 in vitro

Източник: https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2020.104787Get rights and content

Превод: Боряна Маринкова

LeonCaly1Julian D.Druce1Mike G.Catton1David A.Jans2Kylie M.Wagstaff2

Източник: https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2020.104787Get rights and content

Акценти

• Ивермектин е инхибитор на предизвикващия COVID-19 вирус (SARS-CoV-2) in vitro.
• Еднократен курс на лечение, който е в състояние да повлияе на 5 000 пъти намаляване на вируса за 48 часа в клетъчната култура.
• Ивермектин е одобрено от FDA антипаразитно лекарство и следователно има потенциал за репозициониране.
• Ивермектин е широко достъпен поради включването му в списъка на СЗО за съществените лекарства

Резюме

Въпреки че в момента се провеждат няколко клинични проучвания за тестване на възможни терапии, отговорът в световен мащаб на разпространението на COVID-19 е до голяма степен ограничен до мониторинг / ограничителни мерки. Тук съобщаваме, че Ивермектин, одобрен от FDA анти-паразитен препарат по-рано е показал, че има широкоспектърна антивирусна активност in vitro, е инхибитор на причинителя на вируса (SARS-CoV-2), с еднократно допълнение към Vero-hSLAM клетки 2 часа след заразяването със SARS-CoV-2, способни да създадат до 5000-кратно намаляване на вирусната РНК за 48 часа. Следователно Ивермектин ще бъде задължително обект допълнително проучване за възможни ползи за хората.

Ивермектин е одобрено от FDA антипаразитно средство с широк спектър1, което през последните години ние, заедно с други групи, показва антивирусна активност срещу широк спектър от вируси2, 3, 4, 5 in vitro. Първоначално идентифициран като инхибитор на взаимодействието между протеина на интеграза на човешкия имунодефицитен вирус-1 (ХИВ-1) и хетеродимера на импортина (IMP) α / β1, отговорен за ядрения внос на IN6, като още оттогава е потвърдено, че Ивермектин инхибира IN ядрен внос и ХИВ-1 репликация5. Съобщавани са други действия на ивермектин7, но е показано, че ивермектинът инхибира ядрения внос на гостоприемника (напр. 8, 9) и вирусни протеини, включително Simian virus SV40 туморен антиген и неструктурния протеин 5 на вируса на денга (DENV)5, 6. Важното е, че е доказано, че той ограничава инфекцията от РНК вируси като DENV 1-44, Западен Нилски вирус10, венецуелски вирус на енцефалит по конете (VEEV) 3 и грип2, като тази широкоспектърна активност се смята, че се дължи на зависимостта от много различни РНК вируси от IMPα / β1 по време на инфекция11,12. Подобно е показано, че Ивермектин е ефективен срещу вируса на псевдораби на ДНК вируса (PRV) както in vitro, така и in vivo, като лечението с него показа, че увеличава преживяемостта при мишки, заразени с PRV13. Не е наблюдавана ефикасност при ивермектин срещу Зика вирус (ZIKV) при мишки, но авторите признават, че ограниченията на изследването оправдават преоценката на активността на ивермектина спрямо ZIKV14. И накрая, ивермектин беше в центъра на клинично изпитване във фаза III в Тайланд през 2014-2017 г. срещу DENV инфекция, при която се наблюдаваше, че еднократна дневна перорална доза е безопасна и води до значително намаляване на серумните нива на вирусен протеин NS1, но не са наблюдавани промени във виремията или клиничната полза (вижте по-долу)15.

Причинителят на настоящата пандемия COVID-19, SARS-CoV-2, е едноверижен положителен РНК вирус, който е много близък до коронавируса на остър респираторен синдром (SARS-CoV). Проучвания на SARS-CoV протеини разкриват потенциална роля за IMPα / β1 по време на инфекция при зависещо от сигнала нуклеоцитоплазмено затваряне на нуклеокапсидния протеин SARS-CoV16, 17, 18, което може да повлияе на клетъчното делене19,20. Освен това е показано, че SARS-CoV аксесоарният протеин ORF6 антагонизира антивирусната активност на транскрипционния фактор STAT1 чрез секвестриране на IMPα / β1 върху грубата ER / Golgi мембраната21. Общо погледнати тези доклади предполагат, че инхибиращата активност на ивермектин може да бъде ефективна срещу SARS-CoV-2.

За да изследваме антивирусната активност на ивермектин към SARS-CoV-2, заразихме Vero / hSLAM клетки с SARS-CoV-2 изолат Австралия / VIC01 / 2020 при MOI от 0,1 за 2 часа, последвано от добавяне на 5 µM ивермектин. Супернатанта и клетъчните пелети бяха събрани на дни 0-3 и анализирани с RT-PCR за репликация на SARS-CoV-2 РНК (фиг. 1А / В). На 24 часа имаше 93% намаление на вирусна РНК, присъстваща в супернатантата (показателно за освободени вириони) на проби, третирани с ивермектин, в сравнение с носителя DMSO. По подобен начин е наблюдавано намаление с 99,8% на свързана с клетки вирусна РНК (показателна за неосвободени и непакетирани вириони) при лечение с ивермектин. До 48мия час този ефект се увеличава до 5 000-кратно намаление на вирусна РНК при третиране с ивермектин в сравнение с контролните проби, което показва, че ивермектиновото третиране води до ефективна загуба на почти всички вирусни материали за 48 часа. В съответствие с тази логика, не се наблюдава по-нататъшно намаляване на вирусна РНК на 72ия час. Както вече наблюдавахме3, 4, 5, не се наблюдава токсичност на ивермектин при нито една от тестваните времеви точки, нито в зоните за проби, нито в паралелно тествани проби само на лекарството.

Линк за сваляне: Образ с висока резолюция
Линк за сваляне: Образ с оригинален размер

Фигура 1. Ивермектин е силен инхибитор на клиничен изолат на SARS-CoV-2 Australia/VIC01/2020. Клетките Vero / hSLAM бяха инфектирани с SARS-CoV-2 клиничен изолат Австралия / VIC01 / 2020 (MOI = 0.1) в продължение на 2 часа преди добавяне на носител (DMSO) или Ивермектин в посочените концентрации. Пробите са взети на дни в периода 0-3  след заразяването за количествено определяне на вирусен товар, като се използва PCR в реално време на клетъчно свързан вирус (А) или супернатант (В). IC50 стойностите се определят в последващи експерименти при 48 h след заразяването, като се използват указаните концентрации на Ивермектин (третиран 2 часа след заразяването според A / B). Трикратният PCR анализ в реално време се провежда върху клетъчно свързан вирус (C / E) или супернатант (D / F), използвайки проби за гените на SARS-CoV-2 E (C / D) или RdRp (E / F). Резултатите представляват средно ± SD (n = 3). 3 параметрични криви на отговор на дозата бяха изготвени с помощта на призмата GraphPad за определяне на стойностите на IC50 (показано). G. Схематично за предложеното ивермектин антивирусно действие срещу коронавирус. IMPα / β1 се свързва с транспортния протеин на коронавирус в цитоплазмата (отгоре) и го пренася през ядрения порен комплекс (NPC) в ядрото, където комплексът се разпада и вирусният товар може да намали антивирусната реакция на клетката гостоприемник, което води до засилена инфекция. Ивермектин се свързва и дестабилизира хетеродимера на Impα / β1, като по този начин предотвратява свързването на Impα / β1 към вирусния протеин и предотвратява навлизането му в ядрото. Това вероятно води до намалено инхибиране на антивирусните отговори, което води до нормален, по-ефективен антивирусен отговор.

За по-нататъшно определяне на ефективността на ивермектин, клетките, заразени с SARS-CoV-2, бяха третирани със серийни разреждания на ивермектин 2 часа след заразяването и супернатантите и клетъчните пелети, събрани за RT-PCR в реално време на 48мия час (фиг. 1C / D). Както по-горе бе споменати, се наблюдава намаление с> 5000 на вирусна РНК както в супернатантата, така и в клетъчните пелети от проби, третирани с 5 µM ивермектин за 48 часа, което се равнява на 99,98% намаление на вирусна РНК в тези проби. Отново не се наблюдава токсичност при ивермектин при някоя от тестваните концентрации. IC50 за лечение с ивермектин се определя като ∼2μM доза при тези условия. Подчертавайки факта, че анализът наистина конкретно открива SARS-CoV-2, RT-PCR тестовете се повтарят, като се използват праймери, специфични за вирусния RdRp ген (Фиг. 1E / F), а не Е гена (по-горе), с почти идентични резултати, както за освободен (супернатант), така и за свързан с клетките вирус.

Като цяло тези резултати показват, че ивермектин има антивирусно действие срещу клиничния изолат SARS-CoV-2 in vitro, като една доза може да контролира репликацията на вируса в рамките на 24-48 часа по нашата система. Предполагаме, че това е вероятно чрез инхибиране на IMPα / β1-медииран ядрен внос на вирусни протеини (фиг. 1G), както е показано за други РНК вируси4,5,10; потвърждаването на този механизъм в случай на SARS-CoV-2 и идентифицирането на специфичния SARS-CoV-2 и / или на компонента (ите) на гостоприемника (виж10) е важен фокус в бъдещата работа на лабораторния анализ. Разработването на ефективен антивирусен препарат за SARS-CoV-2, ако се приложи на пациенти в началото на инфекция, може да помогне за ограничаване на вирусното натоварване, предотвратяване на тежкото развитие на заболяването и ограничаване на предаването от човек на човек. Бенчмаркинг изследването на ивермектин спрямо други потенциални антивирусни средства за SARS-CoV-2 с алтернативни механизми на действие22, 23, 24, 25, 26 би било важно да се проведе, колкото е възможно по-скоро. Този кратък доклад повдига темата за възможността ивермектин да бъде полезен антивирусен лекарствен продукт за ограничаване на SARS-CoV-2 по подобен начин на тези, за които вече се съобщава22, 23, 24, 25, 26; докато едно от тях не бъде доказано, че е полезно в клинична обстановка, всички трябва да бъдат проучвани възможно най-бързо.

Ивермектин има установен профил на безопасност за човешка употреба1,12,27 и е одобрен от FDA за лечение на редица паразитни инфекции1,27. Важно е да се подчертае, че последните прегледи и мета-анализи показват, че високата доза ивермектин има сравнима безопасност като стандартното лечение с ниски дози, въпреки че няма достатъчно доказателства, за да се направят заключения относно профила на безопасност при бременност28,29. Най-важната следваща стъпка в по-нататъшната оценка за възможна полза при пациенти със COVID-19 ще бъде изследването на режим на дозиране с множество добавки, който наподобява настоящата одобрена употреба на ивермектин при хора. Както беше отбелязано, ивермектин беше в центъра на вниманието на скорошно клинично проучване на фаза III при пациенти с денга в Тайланд, в което беше установено, че една дневна доза е безопасна, но не доведе до никаква клинична полза. Въпреки това, изследователите отбелязват, че може да се разработи подобрен режим на дозиране въз основа на фармакокинетични данни15. Въпреки че DENV очевидно е много различен от SARS-CoV-2, този пробен дизайн трябва да информира бъдещата работа в проучването му. Като цяло настоящият доклад, комбиниран с профил на безопасност, показва, че ивермектин е достоен за по-нататъшно разглеждане като възможен антивирусен продукт срещу SARS-CoV-2.

Методи

Клетъчна култура, вирусна инфекция и лекарствена терапия

Vero / hSLAM клетките30 са в минималната есенциална среда на Earle (EMEM), съдържаща 7% фетален говежди серум (FBS) (Bovogen Biologicals, Keilor East, AUS) 2 mM L-глутамин, 1 mM натриев пируват, 1500 mg / L натриев бикарбонат, 15 mM HEPES и 0,4 mg / ml генетицин при 37 ° C, 5% CO2. Клетките се посяват в 12-ямкови плаки за тъканна култура 24 часа преди заразяването с SARS-CoV-2 (изолат Австралия / VIC01 / 2020) при MOI 0,1 в инфекциозна среда (според хранителната среда, но съдържаща само 2% FBS) за 2 ч. Средата, съдържаща инокулум, се отстранява и се заменя с 1 ml чиста среда (2% FBS), съдържаща Ивермектин, в посочените концентрации или DMSO самостоятелно и се инкубира, както е посочено за 0-3 дни. В подходящия момент, клетъчният супернатант се центрофугира в продължение на 10 минути при 6 000 g, за да се отстранят остатъците и супернатантата се прехвърли в епруветки за чиста колекция. Клетъчните монослоеве се събират чрез остъргване и ресуспендиране в 1 ml чиста среда (2% FBS). Контролите на токсичността бяха зададени паралелно във всеки експеримент върху незаразени клетки.

Генерация на SARS-CoV-2 cДНК

РНК се екстрахира от 200 мкл аликвоти от супернатанта на пробата или клетъчна суспензия, използвайки кит QIAamp 96 Virus QIAcube HT (Qiagen, Hilden, Германия) и се елуира в 60 μl. Обратната транскрипция се извършва с помощта на клетъчния комплект BioLine SensiFAST (Bioline, Лондон, Великобритания), обща реакционна смес (20 μl), съдържаща 10 μL екстракт от РНК, 4 μl 5x буфер TransAmp, 1 μl обратна транскриптаза и 5 μl Nuclease  вода. Реакциите се инкубират при 25 ° С за 10 минути, 42 ° С за 15 минути и 85 ° С за 5 минути.

Детекция на SARS-CoV-2 с помощта на TaqMan RT-PCR анализ в реално време.

TaqMan RT-PCR анализът се провежда, като се използва 2,5 μl cDNA, 10 μl Primer Design PrecisonPLUS qPCR Master Mix 1 μM  Forward (5′-AAA TTC TAT GGT GGT TGG CAC AAC ATG TT-3 ‘), 1 μM Reverse (5’-TAG GCA TAG CTC TRT CAC AYT T-3 ‘) праймери и 0.2 μM проби (5′-FAM-TGG GTT GGG ATT ATC-MGBNFQ-3’), насочени към BetaCoV RdRp (РНК-зависима РНК полимераза) ген или Forward (5 ‘ -ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT -3 ‘), 1 µM Reverse (5′-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A-3′) праймери и 0.2 μM проби (5’-FAM-ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG-286 NFQ-3 ‘) насочен към BetaCoV E-ген31. RT-PCR тестовете в реално време се извършват на приложена Biosystems ABI 7500 Fast PCR в реално време (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ) при използване на циклиращи условия от 95 ° C за 2 min, 95 ° C за 5 s, 60 ° C за 24 s. Като положителна контрола се използва SARS-CoV-2 cDNA (Ct28). Изчислените стойности на Ct се преобразуват в кратно-редуциране на третираните проби в сравнение с контрола по метода ΔCt (сгъната се променя във вирусна РНК = 2 €ΔCt) и се изразяват като% от DMSO самостоятелна проба. Стойностите на IC50 бяха монтирани с помощта на 3 параметрични криви на реакция на дозата в призмата на GraphPad.

Финансиране

Това проучване е финансирано със стипендия на Фондация за борба с рака на гърдата (ECF-17-007) за KMW и NHMRC SPRF (APP1103050) за DAJ.

Литература

1 A. Gonzalez Canga, et al.The pharmacokinetics and interactions of ивермектин in humans–a mini-review

AAPS J, 10 (1) (2008), pp. 42-46, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

2 V. Gotz, et al.Influenza A viruses escape from MxA restriction at the expense of efficient nuclear vRNP import

Sci Rep, 6 (2016), p. 23138, Google Scholar

3 L. Lundberg, et al.Nuclear import and export inhibitors alter capsid protein distribution in mammalian cells and reduce Venezuelan Equine Encephalitis Virus replication

Antiviral Res, 100 (3) (2013), pp. 662-672, ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

4 M.Y. Tay, et al.Nuclear localization of dengue virus (DENV) 1-4 non-structural protein 5; protection against all 4 DENV serotypes by the inhibitor Ивермектин Antiviral Res, 99 (3) (2013), pp. 301-306

ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

5 K.M. Wagstaff, et al.Ивермектин is a specific inhibitor of importin alpha/beta-mediated nuclear import able to inhibit replication of HIV-1 and dengue virus The Biochemical journal, 443 (3) (2012), pp. 851-856

View Record in ScopusGoogle Scholar

6 K.M. Wagstaff, et al.An AlphaScreen(R)-based assay for high-throughput screening for specific inhibitors of nuclear import Journal of biomolecular screening, 16 (2) (2011), pp. 192-200

CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

7 E. Mastrangelo, et al.Ивермектин is a potent inhibitor of flavivirus replication specifically targeting NS3 helicase activity: new prospects for an old drug The Journal of antimicrobial chemotherapy (2012) Google Scholar

8 F.K. Kosyna, et al.The importin alpha/beta-specific inhibitor Ивермектин affects HIF-dependent hypoxia response pathways Biol Chem, 396 (12) (2015), pp. 1357-1367, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

9 P.J. van der Watt, et al.Targeting the Nuclear Import Receptor Kpnbeta1 as an Anticancer Therapeutic Mol Cancer Ther, 15 (4) (2016), pp. 560-573, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

10 S.N.Y. Yang, et al.The broad spectrum antiviral ивермектин targets the host nuclear transport importin alpha/beta1 heterodimer Antiviral Res (2020), p. 104760, ArticleDownload PDFGoogle Scholar

11 L. Caly, K.M. Wagstaff, D.A. JansNuclear trafficking of proteins from RNA viruses: Potential target for anti-virals? Antiviral research, 95 (2012), pp. 202-206, ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

12 D.A. Jans, A.J. Martin, K.M. WagstaffInhibitors of nuclear transport Curr Opin Cell Biol, 58 (2019), pp. 50-60

ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

13 C. Lv, et al.Ивермектин inhibits DNA polymerase UL42 of pseudorabies virus entrance into the nucleus and proliferation of the virus in vitro and vivo Antiviral Res, 159 (2018), pp. 55-62, ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

14 H. Ketkar, et al.Lack of efficacy of ивермектин for prevention of a lethal Zika virus infection in a murine system Diagn Microbiol Infect Dis, 95 (1) (2019), pp. 38-40, ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

15 Yamasmith, E., et al., Efficacy and Safety of Ивермектин against Dengue Infection: A Phase III, Randomized, Double-blind, Placebo-controlled Trial, in he 34th Annual Meeting The Royal College of Physicians of Thailand- ‘Internal Medicine and One Health. 2018: Chonburi, Thailand. Google Scholar

16 R.R. Rowland, et al.Intracellular localization of the severe acute respiratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein: absence of nucleolar accumulation during infection and after expression as a recombinant protein in vero cells J Virol, 79 (17) (2005), pp. 11507-11512, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

17 K.A. Timani, et al.Nuclear/nucleolar localization properties of C-terminal nucleocapsid protein of SARS coronavirus Virus Res, 114 (1-2) (2005), pp. 23-34, ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

18 W.N. Wulan, et al.Nucleocytoplasmic transport of nucleocapsid proteins of enveloped RNA viruses Front Microbiol, 6 (2015), p. 553, Google Scholar

19 J.A. Hiscox, et al.The coronavirus infectious bronchitis virus nucleoprotein localizes to the nucleolus J Virol, 75 (1) (2001), pp. 506-512, View Record in ScopusGoogle Scholar

20 T. Wurm, et al.Localization to the nucleolus is a common feature of coronavirus nucleoproteins, and the protein may disrupt host cell division J Virol, 75 (19) (2001), pp. 9345-9356, View Record in ScopusGoogle Scholar

21 M. Frieman, et al.Severe acute respiratory syndrome coronavirus ORF6 antagonizes STAT1 function by sequestering nuclear import factors on the rough endoplasmic reticulum/Golgi membrane J Virol, 81 (18) (2007), pp. 9812-9824, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

22 L. Dong, S. Hu, J. GaoDiscovering drugs to treat coronavirus disease 2019 (COVID-19) Drug Discov Ther, 14 (1) (2020), pp. 58-60, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

23 A.A. ElfikyAnti-HCV, nucleotide inhibitors, repurposing against COVID-19 Life Sci, 248 (2020), p. 117477, ArticleDownload PDFGoogle Scholar

24 C.J. Gordon, et al.The antiviral compound remdesivir potently inhibits RNA-dependent RNA polymerase from Middle East respiratory syndrome coronavirus J Biol Chem (2020), Google Scholar

25 G. Li, E. De ClercqTherapeutic options for the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) Nat Rev Drug Discov, 19 (3) (2020), pp. 149-150, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

26 M. Wang, et al.Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro Cell Res, 30 (3) (2020), pp. 269-271, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

27 D. Buonfrate, et al.Multiple-dose versus single-dose ивермектин for Strongyloides stercoralis infection (Strong Treat 1 to 4): a multicentre, open-label, phase 3, randomised controlled superiority trial Lancet Infect Dis, 19 (11) (2019), pp. 1181-1190, ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

28 M. Navarro, et al.Safety of high-dose ивермектин: a systematic review and meta-analysis J Antimicrob Chemother, 75 (4) (2020), pp. 827-834, CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

29 P. Nicolas, et al.Safety of oral ивермектин during pregnancy: a systematic review and meta-analysis Lancet Glob Health, 8 (1) (2020), pp. e92-e100, ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

30 N. Ono, et al.Measles viruses on throat swabs from measles patients use signaling lymphocytic activation molecule (CDw150) but not CD46 as a cellular receptor J Virol, 75 (9) (2001), pp. 4399-4401, View Record in ScopusGoogle Scholar

31V.M. Corman, et al.Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR Euro Surveill, 25 (3) (2020), Google Scholar